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摘要糖基化修饰几乎存在于所有生物进程中，对改善天然产物的理化性质以及增强生物大分子的生物活性有着重要意义。而半乳糖基化修饰则是最常见的糖基化修饰之一，发生在胚胎发育、神经系统发育、免疫和肿瘤的发生发展等多种生命活动过程中。因此，对半乳糖基化修饰展开研究有着重要意义。目前，化学法和基于糖苷酶以及糖基转移酶的酶法是主要的糖基化修饰技术，但通常存在操作繁琐、得率低或糖基供体价格昂贵难以大规模应用等难题。而基于糖苷合成酶的酶法则不存在上述困扰，以氟代糖为糖基供体，制作成本较低且只催化合成反应，产率较高。但氟代糖稳定性较差的问题限制了糖苷合成酶的发展，因此，亟需探索能够提高氟代糖稳定性的合成方法，以增强糖苷合成酶在糖基化修饰中的进一步应用。<br>　　本论文首先对半乳糖苷合成酶的糖基供体氟代半乳糖的合成方法加以改进，探索提高其稳定性的处理方法。然后通过NCBI基因文库获得Bacilluscirculans和Bacteroidesthetaiotaomicron来源的两种半乳糖苷合成酶的基因序列NcBGalE233G和BtAGalD415G。基因合成后经表达纯化得到重组蛋白，以自行合成的糖基供体对两种半乳糖苷合成酶的进行底物特异性探究并探索其在各种半乳糖基化修饰中的应用。具体研究内容如下：<br>　　1.氟代半乳糖的合成方法改进及其在半乳糖苷合成酶催化反应中的底物特异性<br>　　经全乙酰化、氟取代以及脱乙酰保护三个步骤合成了半乳糖苷合成酶的糖基供体氟代半乳糖，经由TLC、MALDI-TOF-MS、LC-MS等方法验证。同时在合成过程中探索提高氟代半乳糖稳定性的处理方法，在脱乙酰保护时首次采用了共旋干的方法，即在除去甲醇的同时将氟代半乳糖保存在盐溶液中，使其以一定浓度的溶液形式存在。这种处理方法提高了氟代半乳糖的稳定性，经过验证这种方法制备的氟代半乳糖可以在-20℃条件下保存一个月以上。将合成的质粒导入大肠杆菌表达细胞中进行异源表达，并通过镍柱亲和层析纯化得到重组蛋白。经SDS-PAGE验证可以得出结论：两种半乳糖苷合成酶基因可成功通过镍柱纯化，目的蛋白分子量与理论大小一致。随后以自行合成的氟代半乳糖为糖基供体，19种对硝基苯基糖苷为受体，对两种半乳糖苷合成酶进行进一步的转糖基底物特异性探究，并由HPLC和MALDI-TOF-MS进行验证。结果表明：NcBGalE233G对6种受体有转糖基活性，在现有研究结果的基础上扩充了2种底物（pNP-β-GlcNAc和pNP-β-Cellobiose）；而BtAGalD415G对4种受体有转糖基活性，在现有研究结果的基础上扩充了1种底物（pNP-α-GlcNAc）。<br>　　2.半乳糖苷合成酶在糖基化修饰中的应用<br>　　根据底物特异性探究的结果，将NcBGalE233G和BtAGalD415G应用于各种糖基化修饰中，并通过HPLC、MALDI-TOF-MS、TLC等方法验证。结果表明：在O-糖基化修饰中，NcBGalE233G催化合成了连接在多肽EA2上的TF抗原，产率可达25%以上；在N-糖基化修饰中，NcBGalE233G可以在N-链寡糖A2XF上连接1-2个Gal，BtAGalD415G则只能在A2XF上连接1个Gal；除此之外BtAGalD415G还可在N-链寡糖MMXF上连接1个Gal，合成一种全新的N-链寡糖结构；而在抗生素糖基化修饰中，两种半乳糖苷合成酶均无糖基化修饰产物生成。