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摘要背景：牙龈卟啉单胞菌（Porphyromonasgingivalis,Pg）主要定植于口腔牙周组织，与牙周炎及多种全身性疾病相关。菌毛蛋白（FimA）是Pg重要的致病因子之一，能够作为Pg疫苗的候选抗原。为了增强FimA在局部黏膜的免疫原性，Pg疫苗需要配合黏膜佐剂共同进行免疫实验。霍乱毒素B亚基（CTB）能够增强上皮细胞的渗透性，提高抗原蛋白的免疫原性，是目前公认的能够有效增强黏膜免疫应答的黏膜佐剂。<br>　　目的：利用基因工程技术构建FimA与CTB连接的重组融合蛋白CTB-FimA；观察CTB-FimA重组蛋白作为候选疫苗的黏膜免疫效果，为预防口腔牙龈卟啉单胞菌感染疫苗的研制奠定基础。<br>　　方法：（1）根据GenBank查找FimA基因和CTB基因，利用柔性连接肽（Gly4Ser）3序列连接两段基因构建pET-32a/CTB-FimA原核表达质粒，转化至大肠杆菌BL21(DE3)；双酶切和测序鉴定重组质粒。（2）利用Expasy软件ProtParam工具预测蛋白分子量和亲水性；确定可溶性蛋白的最适表达条件。（3）利用Ni-NTA柱亲和层析和凝胶过滤层析纯化CTB-FimA重组蛋白；Westernblotting鉴定目的蛋白；ImageJ软件分析蛋白纯度；TEV酶切去除CTB-FimA重组蛋白6×His标签。（4）利用纯化的目的蛋白作为免疫原滴鼻免疫BALB/c小鼠，ELISA测定各组小鼠血清特异性IgG抗体和唾液sIgA抗体水平。Pg感染小鼠口腔，观察CTB-FimA重组蛋白疫苗的黏膜免疫保护效果。<br>　　结果：（1）pET-32a/CTB-FimA重组质粒鉴定：重组质粒pET-32a/CTB-FimA经酶切后凝胶电泳，结果显示与目的基因片段大小相符；基因测序与设计序列一致，无突变位点，说明重组质粒pET-32a/CTB-FimA构建成功。Expasy软件ProtParam工具预测重组蛋白分子量约为72.08kDa，亲水性总平均值为-0.313，亲水性良好。<br>　　（2）CTB-FimA蛋白诱导表达条件探索：CTB-FimA既有包涵体表达，又有可溶性表达，重组菌体pET-32a/CTB-FimA在含5g/L葡萄糖的LB培养基中加入0.5mMIPTG、23℃诱导24h，CTB-FimA可溶性蛋白表达量最高。<br>　　（3）CTB-FimA蛋白纯化：采用两步纯化法，先通过Ni-NTA柱亲和层析除去大量非特异性蛋白，再利用分子筛凝胶过滤层析获得纯度＞90%的CTB-FimA重组蛋白；Westernblotting验证CTB-FimA重组蛋白，其能够与6×His抗体结合，说明目的蛋白表达成功；每升发酵液表达CTB-FimA蛋白约100mg，表达量较高。<br>　　（4）CTB-FimATEV酶切分析：酶切产物经SDS-PAGE电泳可见到与预期分子量大小相近的条带，证明His标签切割成功，产物可经Ni-NTA柱去除标签获得目的蛋白。<br>　　（5）重组蛋白免疫效果和攻毒实验：分别对BALB/c小鼠滴鼻免疫FimA抗原（40μg）、FimA抗原（20μg）与CTB佐剂（20μg）混合物和CTB-FimA重组蛋白（40μg），5周后ELISA测定血清IgG抗体和唾液特异性sIgA抗体，结果显示FimA组IgG抗体水平最高；CTB-FimA重组蛋白组产生的sIgA抗体效价显著高于FimA组和FimA+CTB组（P＜0.05），表明CTB-FimA重组蛋白黏膜免疫效果最强。Pg攻击小鼠口腔，PCR检测各组小鼠口腔Pg感染率。结果显示CTB-FimA组口腔Pg感染率最低。说明CTB-FimA重组蛋白疫苗能够降低口腔Pg感染率，有一定的黏膜免疫保护作用。<br>　　结论成功制备重组蛋白疫苗CTB-FimA，滴鼻免疫动物能够产生高效价sIgA抗体，降低口腔Pg感染率，为防治口腔Pg感染疫苗的研制奠定基础。