棕榈酰化修饰促进IFNGR1溶酶体降解在P.gingivalis阳性食管癌免疫调控中的机制研究-论文-万方医学网

棕榈酰化修饰促进IFNGR1溶酶体降解在P.gingivalis阳性食管癌免疫调控中的机制研究

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摘要目的： 　　研究牙龈卟啉单胞菌（Porphyromonas gingivalis，P. gingivalis）作用于食管鳞癌细胞，通过对亨廷顿互作蛋白 1 相关蛋白（Huntingtin-interacting protein 1-related protein，HIP1R）的调节，促使 HIP1R和干扰素受体 1（Interferon gamma receptor 1，IFNGR1）相互作用，进一步针对棕榈酰化修饰的 IFNGR1 以溶酶体途径降解过程，对T细胞介导的细胞毒性作用的变化而影响食管肿瘤免疫微环境机制的研究。 　　方法： 　　第一部分：P. gingivalis感染 ESCC差异基因的筛选及功能分析 　　1. 通过对KYSE150细胞进行RNA及蛋白测序，选出与P. gingivalis和ESCC关系最密切的蛋白。免疫组化检测随机选取的149例食管癌患者组织蜡块切片，对同一切片分别进行P. gingivalis、HIP1R和IFNGR1染色，并对其结果采用spss软件进行统计分析，运用 R Studio 对统计结果进行相关性分析；对 HIP1R 高、低表达组中免疫细胞的浸润丰度进行分析； 　　2. Western blot 检测 HIP1R 蛋白在不同细胞系中的表达，同时研究 P. gingivalis感染KYSE70及KYSE150后细胞内蛋白表达量随着时间推移而发生的变化； 　　3. 对 HIP1R 进行过表达及敲降，通过激光共聚焦显微镜观察转染效率， western blot 验证其过表达及敲降情况；采用平板克隆、划痕实验、Transwell 等功能学实验方法，检测HIP1R过表达或敲降时，KYSE70及KYSE150细胞增殖，迁移和侵袭情况。 　　第二部分：P. gingivalis感染促进 HIP1R-IFNGR1相互作用 　　1. Western blot 实验检测 IFNGR1 在不同细胞系内的表达，并研究 P. gingivalis感染 KYSE70及 KYSE30后细胞内蛋白表达量随着时间推移而发生的改变； 　　2.免疫组化检测同一蜡块的连续切片中 P. gingivalis、HIP1R 和 IFNGR1 表达，运用 SPSS软件统计分析，R Studio对统计结果进行相关性分析； 　　3.分子对接方法预测HIP1R-IFNGR1是否存在相互作用关系；通过免疫共沉淀以及免疫荧光实验验证HIP1R-IFNGR1是否存在相互作用关系； 　　4. 构建 HIP1R 不同位点质粒，激光共聚焦显微镜下观察转染效率；western blot法检测IFNGR1与HIP1R发生相互作用的具体位点。 　　第三部分：P. gingivalis感染促进 HIP1R靶向 IFNGR1以溶酶体途径降解 　　1. Bafilomycin（溶酶体自噬抑制剂）和 MG132（蛋白酶体抑制剂）对IFNGR1进行处理，研究IFNGR1的降解方式； 　　2. 通过环己酰亚胺（Cycloheximid，CHX）追踪实验，研究HIP1R敲降及过表达后对IFNGR1的半衰期的影响； 　　3. 通过Css-plam网站对IFNGR1棕榈酰化位点进行预测，并构建IFNGR1棕榈酰化位点突变质粒，激光共聚焦显微镜检测 IFNGR1-C122A 转染效率，并采用click-it实验检测IFNGR1的棕榈酰化修饰； 　　4. 体外转入棕榈酰基转移酶 ZDHHC3质粒，研究外源性棕榈酰化对 HIP1R-IFNGR1相互作用的影响。 　　第四部分：IFNGR1对T细胞介导的细胞毒性作用的影响 　　1. 构建 CDX 人源性小鼠模型。通过鼠尾静脉注射 PBMC，将处理好的KYSE150细胞对小鼠进行皮下荷瘤； 　　2. 对小鼠瘤体进行免疫组化及 RNA scope检测瘤体内 P. gingivalis和 HIP1R表达； 　　3. 通过对 KYSE150和 PBMC体外共培养，流式细胞术检测上清液中穿孔素及IFN-γ的含量。 　　结果： 　　第一部分：P. gingivalis感染 ESCC差异基因的筛选及功能分析 　　1. 通过对 KYSE150 细胞进行 RNA 及蛋白测序，识别并筛选出目标蛋白HIP1R。免疫组化结果分析得到在食管癌组织内 P. gingivalis 与 HIP1R 呈正相关，且HIP1R高表达和更差的五年生存率相关； 　　2. Western blot 实验证明 HIP1R 在食管癌细胞系内特异性高表达；且 P. gingivalis可上调HIP1R在食管鳞癌细胞系内的表达； 　　3. 通过对 HIP1R 免疫微环境进行分析，结果表明 HIP1R 高表达组表现出免疫抑制作用； 　　4. HA-HIP1R 及 si-HIP1R 转染成功；HA-HIP1R 促进 KYSE70 和 KYSE150的增殖，迁移和侵袭；si-HIP1R抑制KYSE70和KYSE150的增殖，迁移和侵袭。 　　第二部分：P. gingivalis感染促进 HIP1R-IFNGR1相互作用 　　1. Western blot 证明 IFNGR1 在食管癌细胞 KYSE30 内高表达，在 KYSE70细胞内低表达； 　　2. 免疫组化实验证明 P. gingivalis与 IFNGR1表达呈负相关，且 IFNGR1表达与更差的五年生存率相关； 　　3. 分子对接预测结果显示HIP1R与IFNGR1存在相互作用关系；免疫共沉淀及免疫荧光结果表明 P. gingivalis感染促进 HIP1R-IFNGR1相互作用； 　　4. 通过构建不同位点突变的 HIP1R 质粒，结果表明 HIP1R 在 814 位点与IFNGR1发生相互作用。 　　第三部分：P. gingivalis感染促进 HIP1R靶向 IFNGR1以溶酶体途径降解 　　1. Bafilomycin 处理后，IFNGR1 在对 HIP1R 敲降后的 KYSE70 内蛋白表达量增加；而经 MG132 处理后，IFNGR1 的蛋白表达量基本无改变。进一步说明IFNGR1可能被转运到溶酶体，并在溶酶体内进行降解； 　　2. 通过 CHX实验证明 HIP1R过表达时 IFNGR1的半衰期更短，即 HIP1R对IFNGR1存在调控作用； 　　3. 通过 click-it实验证明 IFNGR1在 Cys122位点是发生棕榈酰化修饰，且 P. gingivalis可以促进IFNGR1在ESCC内发生棕榈酰化修饰; 　　4. 免疫共沉淀实验及免疫荧光实验表明，转入 ZDHHC3 质粒后，促进HIP1R-IFNGR1发生相互作用，进一步说明棕榈酰化促进HIP1R-IFNGR1相互作用。 　　第四部分：IFNGR1对T细胞介导的细胞毒性作用的影响 　　1. 通过鼠尾静脉注入 PBMC，并根据实验分组对小鼠进行皮下荷瘤，构建人源性CDX小鼠模型； 　　2. 体外对PBMC和KYSE150细胞共培养，流式细胞术结果表明P. gingivalis及棕榈酰化修饰均降低上清液中穿孔素及IFN-γ表达。 　　结论： 　　1. HIP1R在食管鳞癌内特异性高表达，过表达HIP1R对KYSE70、KYSE150增殖、迁移和侵袭有促进作用； 　　2. P. gingivalis上调 HIP1R的表达，并促进 HIP1R-IFNGR1相互作用； 　　3. IFNGR1在Cys122A位点发生棕榈酰化；ZDHHC3促进HIP1R-IFNGR1相互作用； 　　4. P. gingivalis感染或 IFNGR1棕榈酰化均可以促进 HIP1R靶向 IFNGR1以溶酶体途径降解； 　　5. P. gingivalis感染促进IFNGR1的下调，使穿孔素和IFN-γ表达减少，进而影响肿瘤免疫微环境，进一步促进肿瘤的生长。