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摘要淋巴液生成、运输、流出或淋巴管功能的失衡都可能导致淋巴水肿。尤其是手术后的患者若淋巴管受损，通常会导致淋巴液渗漏和回流受阻，造成组织内液体潴留，在临床上主要表现为组织水肿，继发慢性炎症并伴随组织纤维化。然而，这种疾病的发生发展以及恶化的分子机制仍不清楚。尽管该病的发病率逐年攀升，但临床治疗手段却十分有限，通常采用物理治疗而效果常不如人意，手术治疗则造成对淋巴管系统的进一步损伤，可能加重水肿症状，开发此疾病的靶向疗法迫在眉睫。<br>　　水通道蛋白家族调控细胞内外水分子通透，它们以囊泡运输的形式被转运到细胞膜上发挥功能。囊泡转运需要细胞内的钙离子参与，而作为重要的钙离子通道，瞬时受体电位粘脂蛋白1（transient receptor potential mucolipin1，TRPML1）通过释放溶酶体内的钙离子调控胞吐和细胞内多种囊泡转运，例如胃酸分泌和溶酶体运输。因此，明确TRPML1是否参与水通道蛋白向细胞膜定向分布，以及炎性因子的分泌，将有助于寻找控制和治疗淋巴水肿发展的干预靶点和开发治疗药物，为临床治疗提供新思路和理论基础。<br>　　研究目的：<br>　　1.探讨TRPML1对淋巴水肿的影响；<br>　　2.明确TRPML1对淋巴水肿中水通道蛋白定位和炎症的影响；<br>　　3.完善和补充淋巴水肿的发生机制。<br>　　研究内容：<br>　　1.利用TRPML1基因敲除鼠，探究TRPML1对淋巴水肿模型中组织水肿程度的影响；<br>　　2.鉴定淋巴内皮细胞主要表达的AQPs亚型，并探索TRPML1对这些亚型的表达水平和分布的影响；<br>　　3.证明TRPML1调控水分子跨淋巴内皮转运，并初步探索其相关机制。<br>　　研究方法：<br>　　1.动物实验：利用TRPML1基因敲除小鼠及野生小鼠分别构建尾部淋巴水肿模型，同时设立假手术组作为手术操作的对照组。记录各组小鼠尾部直径，绘制小鼠尾部淋巴水肿形成和发展曲线；Hamp;E染色观察尾部水肿和炎症情况；通过ELISA试剂盒检测小鼠血清中炎症因子IL-1β和IL-6变化；利用qPCR技术检测小鼠尾部淋巴水肿组织纤维化相关因子TGF-β1、collagen typeⅠ、vimentin和α-SMA的基因表达变化。<br>　　2.细胞与分子实验：通过qPCR和DNA琼脂糖凝胶电泳实验对HLEC细胞内所表达AQPs亚型进行检测和鉴定；利用TRPML1的激动剂ML-SA1、拮抗剂ML-SI1和溶酶体功能抑制剂BafA1对HLEC细胞分别进行处理，然后采用Western blot和共聚焦荧光显微镜检测AQP3和AQP5蛋白的总体表达情况以及它们在细胞膜的分布变化；利用鬼笔环肽染色观察上述处理对细胞骨架的影响；利用calcein-AM观察并连续记录低渗刺激下的HLEC细胞荧光变化，以及比较各组荧光强度的差别。<br>　　研究结果：<br>　　在淋巴水肿体内模型中，淋巴结扎后第6天小鼠尾部开始水肿，第9天尾部直径出现组间明显差异，在第18天以后差异更加显著。WT小鼠皮下组织间隙明显增宽，组织过度疏松，肿胀明显，而TRPML1?/?小鼠水肿症状明显减轻，尾部直径略有增大，尾部组织主要内部结构保持清晰完整，间隙明显变窄。TRPML1?/?模型组与WT模型组相比，炎症因子IL-1β和IL-6浓度都明显降低，组织纤维化标志物TGF-β1、collagen-1、vimentin和α-SMA的基因表达被显著抑制。<br>　　在体外实验中，qPCR结果表明，HLEC细胞内高表达的AQP亚型为AQP3和AQP5；Western blot及免疫荧光染色结果显示，TRPML1并不直接影响HLEC细胞AQP3和AQP5蛋白的整体表达，活化TRPML1将促进AQP3和AQP5向细胞膜分布，并且促进细胞骨架微丝解聚，而这些变化可以被TRPML1抑制剂阻断。TRPML1活化增加了HLEC细胞对水分子的通透性，这种通透性的增加同样可以被TRPML1抑制剂所阻断。<br>　　研究结论：<br>　　TRPML1调控HLEC细胞上AQP3,-5的细胞膜定位，使淋巴内皮细胞的通透性增强，介导淋巴水肿发生以及慢性炎症的发展。TRPML1可能是淋巴水肿的易感因素，也是临床干预的可行靶点。该结果为后续的淋巴水肿及相关炎症的研究提供了新思路，对未来淋巴水肿治疗方案的探索提供了研究基础。