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摘要背景与目的：<br>　　在我国，乳腺癌位居女性恶性肿瘤发病率之首。我国乳腺癌具有发病年龄低、易复发和转移风险高的特点，严重威胁女性健康。近20年来，虽然随着乳腺癌分子分型、手术、放疗、化疗、靶向治疗、内分泌治疗和免疫治疗等技术的发展，乳腺癌患者的总体生存期明显延长。然而，乳腺癌发生和发展机制仍不明确，临床工作中也亟待开发新的生物标志物以满足诊断、评估疗效及预后的需求。<br>　　乳腺癌中主要致癌信号通路包括PI3K/AKT/mTOR和RAS/RAF/MEK通路，它们参与调控细胞增殖、侵袭和其他生物学功能。此外，有丝分裂原活化蛋白激酶（Mitogen-activated protein kinase, MEK）和细胞外信号相关蛋白激酶（Extracellular signal-related protein kinase, ERK）途径可以调控乳酸脱氢酶（Lactate dehydrogenase，LDH），促进糖酵解以重编程癌细胞代谢。<br>　　组织型谷氨酰胺转移酶（Tissue transglutaminase，TG）可以结合和水解三磷酸鸟苷（Guanosine triphosphate, GTP），并催化伯胺与谷氨酰胺残基交联的酶促转酰胺反应。在TGs中，TG2是分布最广且被研究最广泛的。研究发现TG2在多种癌症中表达增加，与耐药性、远处转移和不良预后相关。然而，TG2在乳腺癌中关于糖酵解的相关研究少有报道。因此，我们研究 TG2 在乳腺癌中可能通过调控糖酵解从而影响乳腺癌增殖作用的机制。<br>　　研究方法：<br>　　（1）生物信息学分析TG2在乳腺癌中的表达情况及可能参与的生物学功能和信号通路。首先，利用CCLE网站分析了TG2在多种类型乳腺癌细胞系中的表达情况。然后，通过TIMER和bcgenex网站分析TG2在乳腺癌患者和正常组织中的表达，以及淋巴结转移阳性或阴性情况下的表达情况。同时分析了TG2表达情况与乳腺癌患者总体生存期的关系，以及 TG2 表达水平与不同分子分型的乳腺癌患者总体生存期的关系。随后，通过在线生信网站 linkedomics，对 TG2可能参与的生物学过程和相关基因进行分析，并通过基因富集分析（GSEA）筛选了TG2可能参与的信号通路。<br>　　（2）临床研究纳入了2012年1月至2015年12月在吉林省某三甲医院接受过保乳手术或改良根治术的210名女性乳腺癌患者的癌组织样本。此外，还收集了30例癌旁组织作为对照。研究获得了该医院伦理委员会的批准，并获得了所有患者的书面知情同意书。采用免疫组织化学染色（IHC）检测乳腺癌组织中TG2的表达水平；采用RT-qPCR检测乳腺癌及配对的癌旁组织和乳腺癌细胞系中TG2 mRNA表达水平；通过卡方检验、Kaplan-Meier和Cox回归分析TG2表达与临床病理因素和总体生存期（Overall survival，OS）的相关性。<br>　　（3）RT-qPCR检测人乳腺上皮细胞MCF-10A及人乳腺癌细胞SK-BR-3、BT-474、T47D、ZR-75 和 MCF-7 中 TG2 mRNA 表达，确定高表达和低表达 TG2的细胞株。<br>　　研究结果：<br>　　（1）利用公共数据库进行了相关的生物信息学分析。研究发现在原发肿瘤部位获得的BT-474细胞中TG2水平表达较低，而在转移灶部位获得的SK-BR-3 细胞中 TG2 表达水平较高。对乳腺癌患者的组织样本研究分析发现，TG2 在ER 阴性、PR 阴性、HER-2 阳性亚组中均呈高表达，且淋巴结阳性患者中 TG2的表达高于淋巴结阴性患者。在各分子亚型的分组分析中发现，Luminal B 和HER-2阳性亚组中，TG2高表达患者的总体生存期缩短。KEGG分析发现，TG2可能与DNA复制、糖酵解等生物学功能呈正相关，而与蛋白的胞外运输等呈负相关。通过对TG2相关基因分析发现，TG2与LDHB等基因呈显著正相关，而与MLPH等基因呈显著负相关。我们通过基因富集分析（GSEA）筛选出TG2可能参与调控的信号通路，发现TG2与上皮间质转化、K-RAS和低氧等信号通路相关。<br>　　（2）本研究收集了 30 例癌旁样本和 210 例乳腺癌样本，IHC 染色结果显示，癌旁样本中TG2呈阴性或弱表达水平，而在210例乳腺癌样本中有183例样本中观察到阳性染色，占87.14%。此外，与配对的癌旁样本相比，RT-qPCR证实了 30 例乳腺癌样本中 TG2 mRNA 表达水平更高。在乳腺癌样本中，为分析TG2表达水平与临床病理参数的关系，根据染色强度，分为低表达组（阴性至弱染色）和高表达组（中度至强染色）。Kaplan-Meier分析表明，TG2高表达的患者总体生存期明显较差。Cox回归分析表明，TG2高表达是乳腺癌患者总体生存期的独立危险因素。<br>　　（3）与乳腺上皮细胞系 MCF-10A 细胞相比较，BT-474 细胞中 TG2 mRNA表达较低（P＜0.01）；与MCF-10A细胞相比较，T47D、ZR-75、MCF-7和SK-BR-3 细胞中 TG2 mRNA 表达增加（P＜0.01），在这 4 株细胞中 SK-BR-3 细胞的TG2 mRNA表达最高。<br>　　（4）TG2过表达对乳腺癌细胞增殖的影响<br>　　①应用慢病毒在 BT-474 细胞中过表达 TG2，TG2 过表达的 BT-474 细胞 （OE）中 TG2 mRNA水平增加 2.13 倍（P＜0.01），表明TG2 过表达细胞构建成功。与对照组（Empty vector，EV）相比，CCK-8 结果显示，TG2 过表达细胞的增殖能力增加（72 h OD 450 nm，EV vs OE：1.67±0.12 vs 2.34±0.13，P＜0.05）。<br>　　②为了进一步评估TG2对乳腺癌细胞上皮间质转化的影响，我们对TG2过表达的BT-474（OE）细胞进行了检测。结果显示，TG2过表达可以增强BT-474细胞的迁移和侵袭能力，同时使间质相关蛋白（N-cadherin、Snail、Vimentin和Slug）表达增加（P＜0.05），上皮相关蛋白E-cadherin表达减少（P＜0.05）。<br>　　③为了进一步评估TG2对乳腺癌细胞糖酵解的影响，对TG2过表达的BT-474细胞（OE）进行葡萄糖消耗量和乳酸产量的检测。结果显示，TG2过表达使葡萄糖消耗量和乳酸产量增加（P＜0.05）；TG2 过表达使糖酵解相关的 HKII、PFKP和PKM2蛋白表达增加（P＜0.01）。<br>　　（5）TG2敲减对乳腺癌细胞增殖的影响<br>　　①应用慢病毒在SK-BR-3细胞中敲减TG2（Knockdown，KD），TG2敲减的SK-BR-3 细胞（KD）中TG2 mRNA 水平降低了 73%（P＜0.01），表明 TG2敲减细胞构建成功。与对照组（Scramble control，SC）相比，CCK-8结果显示， TG2 敲减细胞的增殖能力受到抑制（72 h OD 450 nm，SC vs KD：2.87±0.07 vs 2.13±0.09，P＜0.05）。<br>　　②为了进一步评估TG2对乳腺癌细胞上皮间质转化的影响，我们对TG2敲减的SK-BR-3细胞（KD）进行了检测。结果显示，TG2敲减可以降低SK-BR-3细胞的迁移和侵袭能力，同时也使间质相关蛋白（N-cadherin、Snail、Vimentin和Slug）表达下降（P＜0.05），上皮相关蛋白E-cadherin表达增加（P＜0.05）；<br>　　③为了进一步评估TG2对乳腺癌细胞糖酵解的影响，对敲减TG2的SK-BR-3细胞（KD）进行葡萄糖消耗量和乳酸产量的检测。结果显示，TG2敲减使葡萄糖消耗量和乳酸产量明显减少（P＜0.05）；TG2敲减使HKII、PFKP和PKM2蛋白表达减少（P＜0.01）。<br>　　④在TG2敲减细胞中发现，与对照组相比，MEK和ERK的磷酸化降低（P＜0.05）。在这些细胞中还检测到LDHA和LHDB的蛋白（P＜0.05）和mRNA水平降低（P＜0.05）。提示，TG2可通过MEK/ERK/LDH轴调节乳腺癌糖酵解。<br>　　⑤为了进一步证实MEK/ERK/LDH途径在TG2促进乳腺癌细胞增殖中的作用，使用MEK抑制剂U0126进行回复实验。结果提示，U0126抑制SK-BR-3细胞增殖（72h TG2-SC OD 450 nm，DMSO vs U0126：2.84±0.15 vs 2.16±0.19，P＜0.01）；降低葡萄糖消耗量和乳酸产生量（P＜0.01）。<br>　　研究结论:<br>　　（1）组织型谷氨酰胺转移酶2在乳腺癌组织中高表达，并且是乳腺癌患者总体生存期的独立危险因素。<br>　　（2）组织型谷氨酰胺转移酶2可以促进乳腺癌细胞上皮间质转化。<br>　　（3）组织型谷氨酰胺转移酶2通过激活乳腺癌细胞MEK/ERK/LDH通路促进乳腺癌细胞增殖。<br>　　总之，组织型谷氨酰胺转移酶2在乳腺癌中呈高表达，可作为预后的独立危险因素。组织型谷氨酰胺转移酶2可通过激活MEK/ERK/LDH途径促进乳腺癌细胞增殖。