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摘要急性髓性白血病(Acute myeloid leukemia, AML)是一种恶性血液肿瘤，与实体肿瘤不同，其重要特点是幼稚的骨髓细胞异常增殖并聚积，严重影响人类的生命健康。目前，AML的发病机制尚不清楚。已有研究表明，非编码RNA与甲基化修饰参与多种疾病的发展过程，因此，本研究旨在探究AML的RNA分子调控机制。<br>　　首先，我们从GEO数据库下载健康人和AML患者转录组测序数据，通过生物信息学分析筛选出SUCLG2-AS1/miR-17-5p/JAK1轴，并通过体外细胞实验发现过表达SUCLG2-AS1可影响AML细胞的多种生物学功能。其次，通过荧光素酶报告基因实验和RIP实验验证了SUCLG2-AS1与miR-17-5p存在结合关系；通过多种细胞实验证实SUCLG2-AS1可通过竞争性结合miR-17-5p影响JAK1的功能，从而调控AML的增殖，迁移，侵袭和凋亡进程。最后，我们对SUCLG2-AS1的上游调控因子进行分析，发现了与AML发展密切相关的m6A甲基化转移酶 WTAP；通过生信和实验验证了 WTAP 可以调控 AML 中SUCLG2-AS1的甲基化表达，且WTAP高表达与AML患者预后不良相关。<br>　　综上，我们认为，WTAP与SUCLG2-AS1/miR-17-5p/JAK1轴在AML的分子调控过程中发挥了重要作用，其可作为生物标志物，为AML的预防与诊治提供新的指导方向。<br>　　第一部分 AML中lncRNA/miRNA/mRNA共调控网络的构建及关键基因的筛选<br>　　首先，从GEO数据库下载30例AML样本和30例正常样本的转录组测序数据，通过差异表达分析筛选得到664个差异lncRNAs，58个差异miRNAs及3700个差异mRNAs，构建了AML相关的lncRNA/miRNA/mRNA共调控网络。随后，对网络中的靶基因进行GO功能注释和KEGG代谢通路富集分析，并构建蛋白互作网络（PPI）和模块分析，筛选得到SUCLG2-AS1/miR-17-5p/JAK1轴。最后，通过qRT-PCR对其在 AML细胞中的表达水平进行检测，发现SUCLG2-AS1与JAK1在AML细胞内低表达，而miR-17-5p呈高表达，且与生物信息学预测结果一致。因此，SUCLG2-AS1/miR-17-5p/JAK1可作为AML核心信号轴之一，后续将对AML的分子调控机制和生物学功能进行进一步的探究。<br>　　第二部分 lncRNA SUCLG2-AS1 在AML细胞中的生物学功能研究<br>　　首先，我们构建了pcDNA3.1 SUCLG2-AS1过表达质粒，成功转染至AML细胞(THP-1和HL-60）后，利用CCK-8、EdU、transwell、EMT相关蛋白检测和流式细胞凋亡等技术检测AML细胞生物学功能的变化情况。结果如下：CCK-8、EdU实验表明，过表达SUCLG2-AS1可以明显抑制AML细胞的增殖能力；transwell实验检测发现，过表达SUCLG2-AS1可以抑制AML细胞的迁移和侵袭能力；EMT相关蛋白检测发现，过表达SUCLG2-AS1后， AML细胞内E-cadherin 和 N-cadherin 两种蛋白表达变化与 EMT 进程相反，表明过表达SUCLG2-AS1可以抑制EMT过程；细胞凋亡结果证实，过表达SUCLG2-AS1可以促进AML细胞的凋亡。综上结果可知：过表达SUCLG2-AS1可以抑制AML细胞增殖，迁移和侵袭能力，并且促进AML细胞的凋亡，表明SUCLG2-AS1在AML的恶性发展中起到了抑癌作用。<br>　　第三部分 SUCLG2-AS1在AML中的分子调控机制研究<br>　　首先我们通过生信分析和实验（荧光素酶报告基因和RIP实验）证实了SUCLG2-AS1与miR-17-5p存在结合关系。随后，由qRT-PCR检测结果可知， SUCLG2-AS1的过表达明显抑制了miR-17-5p的表达水平，且二者表达水平呈负相关，再次证明SUCLG2-AS1可竞争性结合miR-17-5p。接着，我们在AML细胞系 THP-1 和 HL-60 中转染 miR-17-5p mimics ， miR-17-5p inhibitor 以及pcDNA3.1 SUCLG2-AS1，并利用细胞实验来验证SUCLG2-AS1对miR-17-5p的调控作用。结果证实，miR-17-5p可以促进AML细胞的增殖能力，同时促进AML细胞的迁移和侵袭能力，并能抑制AML细胞的凋亡进程；而在对细胞进行共转染pcDNA3.1 SUCLG2-AS1和miR-17-5p mimics后，miR-17-5p对AML细胞调控作用发生了逆转。表明SUCLG2-AS1可通过竞争性结合miR-17-5p来调控AML细胞的生物学过程。<br>　　我们同样通过上述研究方法证实，miR-17-5p与JAK1存在结合关系。且利用Western Blotting实验再次检测JAK1的表达情况，结果显示，JAK1在AML细胞内显著下调。同时， qRT-PCR和 Western Blotting 实验检测证明，转染miR-17-5p mimics后可明显抑制JAK1的表达；转染pcDNA3.1 SUCLG2-AS1后可促进JAK1的表达；同时转染pcDNA3.1 SUCLG2-AS1和miR-17-5p mimics，可使JAK1的表达水平趋近于正常。以上实验结果证实SUCLG2-AS1可通过竞争性结合miR-17-5p来调控JAK1的表达。<br>　　最后，我们构建JAK1过表达质粒pcDNA3.1 JAK1，并利用上述实验方法进行检测。结果表明，过表达miR-17-5p可显著抑制JAK1的表达；而过表达JAK1可显著抑制AML细胞的增殖、侵袭、迁移，同时促进AML细胞凋亡，而这一结果可在共转染 miR-17-5p mimics 和 pcDNA3.1 JAK1 后，发生逆转。表明miR-17-5p可通过竞争性结合JAK1来影响AML的发展进程。<br>　　第四部分 WTAP在AML中的m6A甲基化调控研究<br>　　前面我们研究的是SUCLG2-AS1的下游基因，本节我们又对SUCLG2-AS1的上游调控因子进行了验证与分析。由于大量研究证实WTAP与AML密切相关，因此，我们主要对WTAP的调控机制进行研究。首先，我们通过MeRIP-qPCR实验证实了AML细胞中SUCLG2-AS1的m6A甲基化水平比对照组更丰富。因此，我们对WTAP进行shRNA敲降处理，发现WTAP的下调导致AML细胞中SUCLG2-AS1表达降低，且其m6A甲基化水平也随之降低。通过RNA转录本稳定性实验可知，敲降WTAP后，SUCLG2-AS1的RNA表达降低，即其稳定性降低。提示，AML中SUCLG2-AS1的m6A甲基化受WTAP的调控。接着，我们使用生物信息学方法来分析WTAP与AML的关系。结果显示：AML中WTAP发生了m6A相关的突变，其中总突变率为2.24%，而WTAP的突变率为1%；分层聚类分析结果显示，WTAP在AML样本中呈现高表达；WTAP是AML的危险基因，且其高表达的AML患者总生存率较差。最后，我们利用细胞实验验证了 WTAP 在 AML 细胞中表达显著升高。综上可知， WTAP 可以调控SUCLG2-AS1的甲基化进程，且WTAP的升高与AML患者预后不良相关,可见WTAP在AML的m6A甲基化进程中发挥重要作用。