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摘要CRISPR-Cas 系统由于简单且高效的特性已经成为基因编辑的主流技术，尤其是Cas9和Cas12a系统。但因传统核酸酶自身分子量过大，一般需要双AAV载体递送到体内，降低了基因编辑器的体内递送效率。为了解决这一问题，亟需小型Cas核酸酶的开发和探索。隶属于2类CRISPR-Cas系统中V-F亚型效应蛋白的Cas12f核酸酶，是目前研究发现最紧凑的CRISPR效应核酸酶。其尺寸仅有SpCas9核酸酶的三分之一大小，因此在临床治疗应用中具有巨大潜力。其中，来自硫酸氧化酸杆菌（Acidibacillus sulfurooxidans）的紧凑型 AsCas12f1 蛋白仅由422个氨基酸组成，其可以在RNA引导下通过识别NTTR（其中R代表A或G）的PAM切割双链DNA。但因其在哺乳动物细胞中编辑效率较低，难以广泛应用于基因编辑领域。<br>　　作为AsCas12f1同家族的Un1Cas12f1和SpaCas12f1基因编辑系统，均已成功通过 sgRNA（tracrRNA-crRNA）优化显著提升了其在细胞中的编辑效率。在Un1Cas12f1系统中，基于sgRNA结构共设计了五种不同的工程化gRNA策略，成功使 Un1Cas12f1 系统在哺乳动物细胞中的编辑效率可以媲美 SpCas9 系统。因此，本研究旨在对紧凑型AsCas12f1基因编辑系统的sgRNA进行系统优化，以提高其在细胞及动物胚胎中的编辑效率，并利用AsCas12f1系统构建模拟人类遗传疾病的动物模型。<br>　　首先，为了验证AsCas12f1系统在细胞上的基因编辑效率，本研究选择符合NTTR PAM（TTTG/TTTA/CTTG/ATTG）要求的 15 个基因靶位点，并在 HEK293T细胞中进行了效率验证。测序结果显示，AsCas12f1系统在上述15个靶位点中，编辑效率均未超过10%，其中插入或删除（Indel）最高的靶位点为PDCD1位点，突变效率为9.31%。这说明AsCas12f1系统的基因编辑效率整体偏低，需进一步优化提升。为了有效提升AsCas12f1系统的编辑效率，本研究对其sgRNA骨架进行如下优化：修饰sgRNA骨架（T4AT6/GGG）；调整crRNA与tracrRNA结合长度（MS）；删减gRNA茎环处无序区域（DS）。然后，将上述效率提升方案进行组合，得到T4AT6和MS组合的sgRNA版本（As-v1），并将其与AsCas12f1蛋白结合的新系统命名为 AsCas12f1-v1。最后，在 HEK293T 细胞中，比较了AsCas12f1-v1系统与AsCas12f1系统和Un1Cas12f1系统的基因编辑效率。结果显示，优化后的AsCas12f1-v1系统在HEK293T细胞中的编辑效率显著提升，优于AsCas12f1系统和Un1Cas12f1系统。<br>　　其次，为了进一步验证 AsCas12f1-v1 系统的基因编辑能力，本研究对小鼠和家兔胚胎进行了基因编辑。首先，我们在小鼠胚胎上选取了Dctn6、Komp、Tyr、Dmd、Polg 5 个靶位点。然后，通过显微注射方式将 AsCas12f1 的 mRNA 与相应的sgRNA混合体系注入小鼠胚胎细胞内。最后，待胚胎发育到囊胚期后，收集胚胎细胞并鉴定AsCas12f1 系统和 AsCas12f1-v1 系统的基因编辑效率。小鼠胚胎的结果显示，与AsCas12f1系统相比，AsCas12f1-v1系统成功在小鼠胚胎五个位点上实现了基因编辑，编辑效率为15.62%-62.47%。此外，我们也在家兔胚胎上选取了 Hbb、Fgf5、Wrn、Otc、Mstn 5 个基因位点进行验证。家兔胚胎的结果显示，与AsCas12f1系统相比，AsCas12f1-v1系统也成功在家兔胚胎上实现了基因编辑，编辑效率为4.75%-16.82%。<br>　　最后，为了证明 AsCas12f1-v1 系统也具备在哺乳动物体内实现基因编辑的能力。我们将含有 mRNA 与 Tyr、Dmd、Foxp1 位点 As-v1 sgRNA的受精卵转移到代孕母鼠中，获得F0代基因编辑小鼠。待小鼠出生7–10天后，对小鼠进行标记并提取基因组进行鉴定。深度测序结果显示，AsCas12f1-v1系统在小鼠体内成功实现了基因编辑，编辑效率分别为：Tyr（38.87%-49.66%），Dmd（33.47%-47.16%），Foxp1（23.41%-37.42%）。此外，我们还分别对Tyr突变，Dmd突变和Foxp1突变小鼠进行了初步的鉴定。结果显示，三个小鼠突变模型均准确模拟出了人类相应疾病的典型症状。<br>　　综上所述，本研究通过对AsCas12f1系统的sgRNA优化，有效提升了其在细胞及动物胚胎中的编辑效率。并利用优化后的 AsCas12f1-v1 系统实现了小鼠体内编辑并构建了模拟人类疾病的动物模型。该研究不仅为紧凑型基因编辑系统的优化提供了理论依据，也为构建人类遗传疾病动物疾病模型提供了新的基因编辑工具。