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摘要多囊卵巢综合征（Polycysticovarysyndrome，PCOS）是育龄女性不孕的主要原因之一，严重影响着育龄女性的生殖健康，其临床特征主要表现为稀发排卵或无排卵、高雄激素血症及卵巢的多囊样改变等。近几十年来，人们在PCOS的病理机制研究和治疗方面已取得很多进展，但由于PCOS的病因多样且复杂，还有诸多问题需进一步阐明，该病的治疗还没有统一标准，其病理机制尚不完全清楚。葛根素（Puerarin）是中药葛根中的主要成分，葛根素注射液可在临床上治疗脑血管和心血管疾病，但其对PCOS的作用及机制仍有待进一步研究。本研究利用DHEA（Dehydroepiandrosterone，脱氢表雄酮）建立PCOS小鼠模型，注射葛根素后发现PCOS小鼠的发情周期恢复，卵巢中囊性卵泡的数量减少，同时恢复了血清中睾酮（T）、黄体生成素（LH）和卵泡刺激素（FSH）水平以及LH/FSH比值，改善了血清中雌激素（E）和孕激素（P4）的异常分泌，表明葛根素对PCOS有良好的治疗作用，但葛根素在PCOS发生中的作用机制尚不明确。<br>　　为进一步研究葛根素缓解PCOS的作用机制，通过对PCOS小鼠和对照组小鼠卵巢进行KEGG通路富集分析，发现差异表达基因主要参与细胞过程、环境信息处理、人类疾病、新陈代谢和有机体系统等过程。在环境信息处理中，差异表达基因在MAPK、cAMP、PI3K-Akt、cGMP-PKG、钙等信号通路中富集。进一步分析PCOS相关基因后发现，差异表达基因在卵巢类固醇生成、类固醇激素生物合成、癌症通路、MAPK和钙信号通路等方面富集。经过筛选后利用免疫蛋白印迹发现，葛根素可降低磷酸化ERK1/2和JNK蛋白在PCOS小鼠卵巢和DHEA处理的卵巢颗粒细胞（Granulosacells，GCs）中的表达。激活ERK1/2和JNK可阻碍葛根素对DHEA处理的GCs分泌功能的改善，调节Bcl2、Bax和Caspase3的表达，使GCs凋亡率明显增多。<br>　　内质网和线粒体是参与调节细胞内钙离子（Ca2+）的重要细胞器。利用流式细胞术分析和荧光显微镜观察可证实，葛根素可降低因DHEA处理后升高的GCs内Ca2+水平，但此效应可被ERK1/2激活剂Ro67和JNK激活剂ANS所阻止。荧光定量PCR检测发现，葛根素可降低内质网Ca2+释放通道Itpr和Ryr在PCOS小鼠卵巢中的表达。Ca2+会通过不同类型的钙通道从细胞间隙内流入或通过细胞内储存的钙释放，诱导细胞质内Ca2+浓度增加，进而会完全激活Calcineurin。Calcineurin是一种Ca2+或钙调蛋白调节的丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酶，其最佳靶点是转录因子Nfatc。在GCs中，抑制Itpr和Ryr可阻碍ERK1/2和JNK介导葛根素对Calcineurin-Nfatc的调控，使细胞内Ca2+减少，GCs分泌功能恢复，Bax和Casp3表达及Casp3活性降低，而Bcl2的表达增加，GCs凋亡率显著减少。抑制Calcineurin-Nfatc可阻碍ERK1/2和JNK介导葛根素对细胞质Ca2+进入线粒体内的调节，进一步利用双萤光素酶报告基因分析发现，线粒体Ca2+单向转运蛋白Mcu的启动子区域包含Nfatc的识别位点，确定Mcu是Nfatc的直接下游靶点。抑制Mcu可使ERK1/2和JNK介导葛根素对线粒体Ca2+的调节作用被抵消，防止因线粒体Ca2+超载而出现的ATP含量降低、线粒体膜电位上升和线粒体通透性转换孔打开的线粒体功能障碍，进而使GCs分泌功能恢复，凋亡率降低。<br>　　综上所述，本研究发现，葛根素通过对ERK1/2/JNK-Calcineurin-Nfatc-Mcu通路的调控，改善GCs的分泌功能，减少GCs凋亡，维持细胞内Ca2+稳态，预防GCs线粒体功能障碍进而对PCOS起到良好的治疗作用。通过本研究可为进一步探明PCOS的发病机制、临床上安全有效的PCOS治疗药物的开发及动物繁殖率的提高等提供重要理论依据。