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摘要亚精胺（Spermidine）存在于所有真核细胞和绝大多数原核细胞中。作为一种阳离子化合物，能够与DNA、RNA、酸性蛋白质以及其他带负电荷的分子结合，参与基因的转录、翻译，调节相关蛋白的表达水平，维持细胞的稳态，对宿主发挥生物学功能具有重要意义。作为一种天然的自噬诱导剂，亚精胺具有诱导自噬、调节免疫、预防心血管疾病等多种生物活性功能。然而，随着年龄的增长，人体内的亚精胺浓度不断降低，补充亚精胺有望成为延长寿命、预防和治疗各种疾病的新策略。利用基因工程手段，将益生菌EscherichiacoliNissle1917（EcN）作为底盘菌，在胞内构建合成亚精胺的异源代谢通路，实现了亚精胺的持续、可控表达，为补充亚精胺提供一种新的途径。<br>　　本研究中，通过对S-腺苷甲硫氨酸脱羧酶（SpeD）和亚精胺合酶（SpeE）在EcN中的异源表达，构建了一种酶催化亚精胺合成的异源途径。以S-腺苷甲硫氨酸（SAM）和腐胺为底物，在SpeD和SpeE的催化下产生亚精胺。主要内容和结果如下：<br>　　（1）单独表达speDH或speET基因的EcN工程菌的构建及全细胞催化。在选择SpeD时，考虑到SpeD是整个催化反应的限速酶，在生物体内催化合成亚精胺的代谢通路中十分关键。因此，根据酶和底物的亲和力（Km值），我们选择了Km值较低的人源的编码SpeD的基因（speDH）和玉米来源的编码SpeD的基因（speDZ），旨在比较两种SpeD在EcN中催化底物合成亚精胺的差异。遗憾的是，构建成功的pBAD-speDZ重组质粒始终无法转化EcN。pBAD-speDH重组质粒成功转化EcN（pBAD-speDH-EcN），后续实验中只对SpeDH在EcN中的催化活性以及合成亚精胺的效率进行探究。我们同样选择了Km值较低的Thermotogamaritima来源的亚精胺合酶基因（speET），通过构建pBAD-speET重组质粒并将其导入EcN中，探究pBAD-speET-EcN催化活性以及合成亚精胺的效率。结果显示：基因工程菌pBAD-speDH-EcN和pBAD-speET-EcN能分别成功表达SpeDH和SpeET。分别以pBAD-speDH-EcN和pBAD-speET-EcN进行全细胞催化，对胞外上清液中的产物亚精胺进行HPLC检测，发现EcN，pBAD-speDH-EcN和pBAD-speET-EcN合成亚精胺的终浓度分别为6.66±0.18μg/mL，19.34±0.57μg/mL和9.95±0.22μg/mL，以上结果表明EcN具有一定的产亚精胺的能力，但合成效率很低；pBAD-speDH-EcN和pBAD-speET-EcN均提高了EcN合成亚精胺的能力，表明SpeDH和SpeET在EcN中均具有催化活性。<br>　　（2）共表达speDH和speET基因的EcN工程菌的构建及全细胞催化。为进一步提高亚精胺的合成效率，我们采用单一转录单元共表达策略，在一个启动子下同时插入speDH基因和speET基因，由于在该策略中两个基因的先后插入顺序会影响蛋白的表达水平，我们同时构建了工程益生菌pBAD-speDH-speET-EcN和pBAD-speET-speDH-EcN，探究SpeDH和SpeET在EcN中的联合表达情况以及合成亚精胺的效率。结果显示，pBAD-speDH-speET-EcN和pBAD-speET-speDH-EcN均可以表达SpeDH和SpeET，共表达载体构建成功。pBAD-speET-speDH-EcN在1mM腐胺底物浓度下，合成亚精胺的终浓度达到19.97±0.42μg/mL，分别是EcN、pBAD-speDH-EcN和pBAD-speET-EcN的3.00倍、1.03倍和2.00倍，与单表达speET的基因工程菌EcN相比，pBAD-speET-speDH-EcN菌株进一步提高了亚精胺合成效率。但与单表达speDH的基因工程菌EcN相比，亚精胺产率变化不明显，推测可能是由于SpeDH在级联催化反应中起关键作用，其酶活较低的原因。pBAD-speDH-speET-EcN在1mM腐胺底物浓度下，合成亚精胺的终浓度达到24.74±0.74μg/mL，分别是EcN、pBAD-speDH-EcN和pBAD-speET-EcN的3.71倍、1.28倍和2.49倍，与单表达speDH和speET的基因工程菌EcN相比，pBAD-speDH-speET-EcN菌株进一步提高了亚精胺合成效率。pBAD-speDH-speET-EcN菌株全细胞催化亚精胺效率最高。<br>　　综上所述，本研究利用基因工程技术在益生菌EcN中设计了亚精胺合成途径，并构建了四种工程益生菌EcN。共表达基因工程EcN可以在体外以腐胺和SAM为底物高效合成亚精胺，提高了全细胞催化亚精胺的合成效率。本研究可能为工程益生菌在延缓衰老以及疾病治疗中提供一种新的策略。