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摘要皮肤光老化（Skinphotoaging）是皮肤老化的头号杀手，是指由于紫外线长期照射而引起的皮肤老化，表现为皮肤粗糙、皱纹加深及色素沉着等。其中长波紫外线（UltravioletA,UVA）含量约占全部紫外线的95%，具有穿透真皮层的能力，在紫外线辐射中发挥重要作用。然而，近年来由于环境污染、臭氧层破坏，过量的紫外线辐射不可避免引起皮肤光老化。特别是随着生活水平的提高，越来越多的人追求美丽、年轻态的皮肤，皮肤光老化已成为困扰人们身心健康的一大难题。因此，阐明皮肤光老化的具体机制对于预防、延缓和治疗皮肤光老化具有重要意义。<br>　　线粒体易受紫外线辐射损伤，而线粒体自噬能够清除受损的线粒体，是线粒体质量控制和稳态维持的关键，对维持个体健康、减缓细胞衰老及防治衰老相关疾病起重要作用。含FUN14域蛋白1（FUN14domaincontaining1,FUNDC1）作为一种新型线粒体自噬受体，通过调控线粒体自噬水平影响多种疾病的进展。课题组前期发现，线粒体自噬途径在衰老骨髓间充质干细胞中的变化最为显著，其中FUNDC1表达明显下调，可能对干细胞衰老具有调控作用。然而，线粒体自噬受体FUNDC1对皮肤光老化是否有调控作用？其作用机制是什么？均不清楚。<br>　　MiRNAs作为一种非编码RNA参与调节机体多种生物学过程，并且与机体多种病理生理过程密切相关。近年来miRNAs在调节皮肤发育、皮肤稳态及皮肤光老化方面的重要性越来越受到关注。我们推测，在光老化过程中，可能存在某些miRNAs通过靶向线粒体自噬受体FUNDC1进而影响皮肤光老化。我们利用生物信息学网站预测并结合文献报道筛选出可能与FUNDC1靶向结合的miR-137-3p，但miR-137-3p对皮肤光老化的作用尚不明确。<br>　　众所周知，P53信号通路在细胞衰老过程中起着核心作用，且自噬与P53信号通路密切相关。我们利用高通量筛选的方法对光老化的人真皮成纤维细胞（Humandermalfibroblasts,HDFs）的自噬差异基因进行KEGG富集分析发现，amp;nbsp;P53信号通路变化显著。由此推测，线粒体自噬受体FUNDC1可能通过调控P53信号通路影响皮肤光老化。然而，实验中我们发现FUNDC1仅调控P53蛋白表达而不影响P53mRNA表达，加入泛素-蛋白酶体抑制剂MG132后，显著逆转了FUNDC1对P53蛋白的调控作用，提示FUNDC1可能通过泛素化降解P53蛋白，进而调控P53蛋白表达。<br>　　蛋白的泛素化是一个级联反应过程，其中E3泛素连接酶是决定靶蛋白特异性识别的关键酶。我们通过在线预测网站对靶向P53的E3泛素连接酶进行预测，并结合已有文献筛选出可能介导P53泛素化的E3泛素连接酶—与锌指结构域1B相邻的溴结构域（Bromodomainadjacenttozincfingerdomain1B,BAZ1B）。然而，目前BAZ1B在蛋白泛素化中的作用尚未证实，BAZ1B能否介导P53的泛素化也无相关报道。我们推测，FUNDC1可能通过BAZ1B介导P53泛素化，进而调控皮肤光老化。<br>　　目的：<br>　　利用细胞光老化模型和小鼠皮肤光老化模型，探讨线粒体自噬受体FUNDC1对皮肤光老化的作用，进一步揭示miR-137-3p靶向FUNDC1通过BAZ1B介导P53泛素化的分子机制，为延缓皮肤光老化提供新思路和新靶点，也为临床防治皮肤光老化提供理论基础和实验依据。<br>　　方法：<br>　　1.利用酶消化法分离获得HDFs，并通过波形蛋白和E钙黏蛋白的免疫荧光染色进行鉴定。采用5J/cm2剂量的UVA照射HDFs，每日照射15min，连续照射3天后，通过观察细胞形态学，检测细胞增殖能力、SA-β-gal活性、衰老相关因子P16INK4a和P21以及皮肤老化相关蛋白MMP1和Collagen-Ⅰ的表达进行评估，建立UVA诱导的HDFs细胞光老化模型。<br>　　2.应用RT-qPCR和Westernblot检测光老化HDFs中FUNDC1的表达水平，通过线粒体自噬特异性试剂盒检测线粒体自噬水平，通过Westernblot检测自噬相关蛋白LC3和P62的表达，并对线粒体功能进行检测（细胞内ROS水平和ATP含量）。<br>　　3.通过siRNA转染和慢病毒感染获得FUNDC1敲减/过表达的HDFs，探究FUNDC1表达的变化对HDFs细胞光老化、线粒体自噬及线粒体功能的影响。4.利用生物信息学网站Targetscan和miRDB预测FUNDC1上游的miRNAs。检测光老化HDFs中miR-137-3p的表达，并通过双荧光素酶报告基因实验验证miR-137-3p与FUNDC1的靶向关系。<br>　　5.分别利用miR-137-3pmimic和inhibitor上调或下调miR-137-3p的表达，然后通过RT-qPCR及Westernblot检测miR-137-3p对FUNDC1表达的调控，进一步探究miR-137-3p表达的变化对HDFs细胞光老化、线粒体自噬及线粒体功能的影响，最后通过功能回复实验阐明miR-137-3p/FUNDC1影响HDFs细胞光老化的机制。<br>　　6.从GEO数据库（GSE119009）中筛选出UVA诱导的光老化HDFs中的差异表达基因，然后与自噬基因集进行交集，并对交集基因进行KEGG富集分析。经过分析筛选出光老化HDFs中显著上调的P53信号通路，进一步探究FUNDC1敲减/过表达后P53的mRNA和蛋白表达水平的变化，然后通过加入泛素-蛋白酶体抑制剂MG132和自噬溶酶体抑制剂Baf-A1，明确FUNDC1对P53蛋白的降解途径。<br>　　7.通过在线预测网站（http://ubibrowser.ncpsb.org/）预测介导P53泛素化的E3泛素连接酶，并结合文献报道，推测BAZ1B可能是介导FUNDC1降解P53的关键泛素连接酶，然后通过Co-IP实验验证BAZ1B与P53之间的相互作用。进一步通过siRNA敲低BAZ1B的表达，探究其对P53蛋白表达及HDFs细胞光老化的调控作用。最后，通过Westernblot检测过表达FUNDC1后BAZ1B的表达变化，并在过表达FUNDC1的细胞中敲减BAZ1B，然后通过Co-IP实验检测P53的泛素化水平，探究FUNDC1是否通过BAZ1B介导P53的泛素化。<br>　　8.采用UVA照射昆明小鼠背部皮肤，每日剂量为20J/cm2，每周照射5次，共8周，然后通过肉眼观察小鼠皮肤的一般状况，HE和Masson染色观察小鼠皮肤的组织形态学结构，RT-qPCR、Westernblot和免疫组织化学染色检测衰老相关因子P16INK4a和P21以及皮肤老化相关蛋白MMP1和Collagen-Ⅰ的表达，建立UVA照射所致的小鼠皮肤光老化模型。<br>　　9.应用RT-qPCR、Westernblot、免疫组织化学染色及Co-IP实验检测小鼠光老化皮肤中FUNDC1、自噬相关蛋白LC3和P62、miR-137-3p、BAZ1B和P53的表达情况以及P53的泛素化水平，从体内实验角度验证miR-137-3p靶向线粒体自噬受体FUNDC1通过BAZ1B介导P53泛素化调控皮肤光老化的作用。<br>　　结果：<br>　　1.通过酶消化法分离获得的HDFs呈长梭形，细胞边界清晰，表达波形蛋白而不表达E钙黏蛋白，细胞纯度在97%以上。经UVA照射后，HDFs体积变大，形态变得铺展，细胞的增殖能力减弱，衰老细胞阳性率及衰老相关因子P16INK4a和P21的mRNA表达水平升高，皮肤老化相关蛋白MMP1表达上调而Collagen-Ⅰ表达下调。说明我们成功构建了UVA诱导的HDFs细胞光老化模型。<br>　　2.光老化HDFs中线粒体自噬受体FUNDC1的mRNA和蛋白表达水平均显著降低。线粒体自噬特异性染色结果显示，相比于对照组，光老化HDFs中红色荧光减弱，同时LC3Ⅱ/Ⅰ的比值下调，而P62的表达水平上调。此外，光老化细胞内ROS水平显著升高，而ATP含量明显降低。说明光老化HDFs中线粒体自噬水平和线粒体功能降低。<br>　　3.敲减FUNDC1后，HDFs中SA-β-gal阳性率及P16INK4a和P21的mRNA表达水平上调，MMP1表达升高而Collagen-Ⅰ表达降低，说明敲减FUNDC1能够促进HDFs细胞光老化。相反，过表达FUNDC1能够减轻UVA照射所致的HDFs细胞光老化，SA-β-gal阳性率及P16INK4a和P21的mRNA表达水平下调，MMP1表达下降而Collagen-Ⅰ表达升高。以上结果表明FUNDC1能够调控HDFs细胞光老化。此外，敲减FUNDC1使细胞的线粒体自噬水平降低，线粒体功能减弱，而过表达FUNDC1则能上调线粒体自噬水平，增强细胞的线粒体功能。<br>　　4.利用生物信息学网站预测出可能与FUNDC1结合的miR-137-3p。RT-qPCR结果显示，与FUNDC1的表达趋势相反，光老化HDFs中miR-137-3p的表达明显高于对照组。双荧光素酶报告基因实验进一步证实miR-137-3p与FUNDC1的3’-UTR区存在相互结合位点，FUNDC1是miR-137-3p的直接靶基因。<br>　　5.在HDFs中过表达miR-137-3p后，FUNDC1表达降低，SA-β-gal阳性率及P16INK4a和P21的mRNA表达水平上调，MMP1表达升高而Collagen-Ⅰ表达降低。相反，抑制miR-137-3p使FUNDC1表达升高，并能改善UVA照射所致的HDFs细胞光老化。此外，过表达miR-137-3p能抑制线粒体自噬，削弱细胞的线粒体功能，而下调miR-137-3p表达则会促进线粒体自噬，增强细胞的线粒体功能。功能回复实验进一步显示，si-FUNDC1与miR-137-3pinhibitor共转染能够逆转FUNDC1敲减引起的FUNDC1表达水平、线粒体自噬及线粒体功能的降低，还可以减轻FUNDC1敲减所致的HDFs细胞光老化。上述结果说明，miR-137-3p可以靶向抑制FUNDC1进而调控HDFs细胞光老化。<br>　　6.对UVA诱导的光老化HDFs中差异表达基因与自噬基因集进行交集后，KEGGPathway富集分析结果显示，光老化HDFs中P53信号通路显著上调。无论是敲低还是过表达FUNDC1，P53的mRNA表达水平均无明显变化；然而，敲低FUNDCD1后P53的蛋白表达升高，而过表达FUNDC1后P53的蛋白表达降低。提示FUNDCD1表达的变化不影响P53的mRNA表达，而P53的蛋白表达则发生显著变化。由此我们推测FUNDC1可能通过某种蛋白降解途径使P53蛋白降解，进而影响P53蛋白表达。此外，在过表达FUNDC1的HDFs中分别加入泛素-蛋白酶体抑制剂MG132和自噬溶酶体抑制剂Baf-A1后发现，MG132显著上调P53的蛋白表达，而Baf-A1则无明显作用，说明FUNDC1可能通过泛素-蛋白酶体途径降解P53，进而调节P53的蛋白表达。<br>　　7.结合在线预测网站的预测结果和文献报道，筛选出BAZ1B可能是介导P53泛素化的关键E3泛素连接酶。进一步通过Co-IP实验证实BAZ1B确实能够与P53相互结合。敲低BAZ1B后P53的蛋白表达明显升高，衰老细胞阳性率及P16INK4a和P21的mRNA表达水平也显著上调，MMP1表达升高而Collagen-Ⅰ表达降低，促进了HDFs细胞光老化。此外，过表达FUNDC1后BAZ1B的蛋白表达也明显升高。Co-IP实验进一步发现，过表达FUNDC1使P53的泛素化水平显著增高，而敲低BAZ1B则能逆转升高的P53泛素化水平。说明FUNDC1通过BAZ1B介导P53泛素化，促进P53降解，从而导致P53的蛋白表达降低。<br>　　8.UVA照射8周后，小鼠背部皮肤粗糙、僵硬，并有色素沉着。HE和Masson染色结果显示，UVA照射使小鼠皮肤的表皮增厚，真皮变薄，真皮层胶原纤维减少且排列紊乱。此外，UVA照射后小鼠皮肤组织中P16INK4a和P21的mRNA表达水平显著上调。免疫组化染色和Westernblot检测结果显示，UVA照射使小鼠皮肤组织中MMP1表达升高而Collagen-Ⅰ表达降低。上述结果说明我们成功构建了UVA照射所致的小鼠皮肤光老化模型。<br>　　9.小鼠光老化皮肤中FUNDC1表达下调，而miR-137-3p表达上调，二者的表达趋势相反。同时，小鼠光老化皮肤中线粒体自噬水平降低，LC3Ⅱ/Ⅰ的比值降低，而P62表达升高。此外，小鼠光老化皮肤中E3泛素连接酶BAZ1B的表达显著降低，P53的泛素化水平也明显降低，而P53的蛋白表达明显升高。<br>　　结论：<br>　　1.在光老化的HDFs中，线粒体自噬受体FUNDC1表达下调，而miR-137-3p表达上调，miR-137-3p对FUNDC1具有靶向负调控作用。<br>　　2.BAZ1B是介导FUNDC1促进P53泛素化的关键E3泛素连接酶。<br>　　3.miR-137-3p靶向FUNDC1通过BAZ1B介导P53泛素化参与调控HDFs细胞光老化。<br>　　4.UVA照射通过上调miR-137-3p抑制FUNDC1的表达，使BAZ1B表达和P53泛素化水平降低，导致P53降解减少，P53蛋白表达升高，进而促进皮肤光老化。