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摘要对于晚期、转移性或复发性前列腺癌患者，雄激素剥夺疗法（ Androgen Deprivation Therapy, ADT）通常是首选的标准治疗方法之一。ADT通过降低体内雄激素水平，诱导细胞衰老和肿瘤停滞，因此成为前列腺癌（Prostate Cancer, PCa）的标准治疗方法。前列腺癌细胞的生长依赖于雄激素受体（Androgen Receptor, AR）的活化。然而，对AR信号的持续抑制实际上会导致从对雄激素敏感的生长转变为对雄激素非敏感性生长，从而促使PCa细胞从ADT诱导的衰老中逃脱（ADT Induced Senescence, AIS），随后发展为去势抵抗性前列腺癌（Castraction-resistant prostate cancer, CRPC）。尽管ADT明显限制了雄激素的水平，但AR途径的异常激活仍在推动CRPC的进展中发挥主导作用。AR剪接变异体如ARv7是AR激活的机制之一。大量证据强调了ARv7在ADT抵抗中的作用，近年来，许多基于转录组的研究揭示了ARv7不仅复制了AR的典型功能，并且还介导了不同于AR的独特基因表达程序，可能对CRPC的进展至关重要。但是，这一现象背后的机制仍然不明确。大多数AR抑制剂靶向雄激素结合或雄激素合成，并且临床上没有针对ARv7的有效和特异性抑制剂。我们拟通过本课题研究ARv7在AIS中的角色和调控机制，从而靶向ARv7下游事件，提高ADT的疗效。<br>　　已有研究表明，ADT能够诱导细胞衰老，表现为衰老相关β-半乳糖苷酶（SA-β-gal）的上调和强烈的G0/G1细胞周期停滞。但ADT并未有效杀死雄激素敏感的PCa细胞，而是在大多数亚群中诱导细胞停滞。这种衰老细胞仍具有新陈代谢活性，并可能通过改变肿瘤微环境从而推动肿瘤进展。ADT诱导的衰老是可逆的，因为细胞可以在雄激素水平恢复后迅速恢复增殖。即使没有雄激素水平的恢复，一小部分细胞甚至可以自发地逃脱ADT诱导的衰老。因此，破译ADT诱导的衰老逃逸机制对于理解CRPC的发展至关重要。这些逃逸机制可能涉及多种因素，包括细胞周期调节、细胞信号通路的重新编程以及肿瘤微环境的改变。通过深入研究这些机制来寻找新的治疗策略，延缓前列腺癌的ADT抵抗，并提高患者的生存率。<br>　　目的：<br>　　本研究通过体外模拟ADT，随后使用慢病毒侵染多种前列腺癌细胞，改变其ARv7表达水平，研究ARv7在ADT作用下前列腺癌细胞AIS进程及CRPC中发挥的作用及其调控机制，探讨ARv7对于PCa细胞ADT抵抗性影响，为克服PCa临床治疗上发生的ADT抵抗提出新的机制及未来研究中潜在靶标。<br>　　方法:<br>　　1.首先利用恩杂鲁胺（Enzalutamide, ENZ）和使用活性炭剥除的血清（CSS）配置的培养基在雄激素敏感的前列腺癌LNCaP细胞模拟ADT，通过衰老相关β-半乳糖苷酶、EdU、流式细胞术、WB检测衰老水平、凋亡程度及衰老标志蛋白表达。<br>　　2.使用慢病毒侵染体外构建两种ARv7表达变化的PCa细胞系：LNCaP（ARv7过表达），22Rv1（沉默内源性ARv7），检测ARv7是否改变了PCa细胞对ADT引起的衰老水平。随后使用Western Blot实验检测ARv7能否调控p27翻译后修饰。<br>　　3.检测SKP2对AIS和p27的调控作用.<br>　　（1）使用RNA-seq在沉默ARv7的22Rv1细胞中检测细胞周期相关基因的表达量变化。<br>　　（2）使用Western Blot和qRT-PCR检测ADT下SKP2的表达水平。<br>　　（3）使用SKP2抑制剂C1检测SKP2对p27和细胞衰老的调节。<br>　　4.检测ARv7作为转录因子对SKP2的直接调控作用。<br>　　（1）在22Rv1细胞中使用ChIP-seq和ChIP-qPCR检测ARv7是否能够与SKP2的启动子发生结合。<br>　　（2）用慢病毒在LNCaP和22Rv1细胞中恒定改变ARv7水平，使用Western Blot和qRT-PCR检测ARv7能否调控SKP2的转录和翻译。<br>　　（3）在内源性不表达AR和ARv7的PC-3细胞中瞬时转染ARv7质粒，检测在AR不存在的条件下，ARv7是否仍能对SKP2发生转录激活。<br>　　5.检测ARv7-SKP2-p27通路在CRPC发展过程中的作用<br>　　（1）长期ADT下，使用Western Blot 检测LNCaP细胞是否发生衰老逃逸以及ARv7-SKP2-p27通路表达水平。<br>　　（2）生物信息学技术分析CRPC患者样本中SKP2的表达情况。<br>　　（3）在长期ADT下形成的内源性表达ARv7的非雄激素依赖型LNCaP-AI细胞中使用Western Blot检测ARv7-SKP2-p27表达水平。<br>　　6.通过克隆形成、MTT实验检测SKP2抑制剂的作用<br>　　（1）使用克隆形成实验检测抑制SKP2对CRPC细胞的生长抑制作用。<br>　　（2）MTT实验检测在LNCaP-AI细胞中恩杂鲁胺和SKP抑制剂的协同作用并使用公式计算出协同指数。<br>　　（3）使用克隆形成实验检测ADT与SKP2抑制剂在CRPC细胞中的协同作用。<br>　　结果：<br>　　1.ADT可以在体外明显诱导细胞衰老、增殖速度下降和细胞G1/S期阻滞，伴有明显的p27激活。<br>　　2.ARv7通过促进p27蛋白泛素化降解来减轻ADT下细胞衰老。<br>　　3.RNA-seq结果显示，在22Rv1细胞中沉默ARv7会导致部分和细胞周期相关的基因表达量下调。在ADT中SKP2表达受到抑制。<br>　　4.ARv7作为转录因子可以直接与SKP2启动子区域结合。qRT-PCR和Western Blot结果显示，ARv7激活SKP2转录，并且这种调控独立于ARv7的母体AR-FL。<br>　　5.细胞由雄激素依赖型向非依赖型转变过程中，ARv7-SKP2-p27通路受到显著激活。对非雄激素依赖型LNCaP和22Rv1细胞使用SKP2抑制剂，能够诱导细胞衰老，周期阻滞和增殖速度下降。<br>　　6.联合指数显示，SKP2抑制剂和ADT联用对去势抵抗型PCa细胞的杀伤能力增强。<br>　　结论：<br>　　1.ARv7通过降解p27，促进与PCa细胞从AIS逃逸。<br>　　2.ARv7能够独立于AR-FL，与SKP2启动子直接结合并激活其转录。<br>　　3.CRPC发生过程与ARv7-SKP2-p27通路激活相关。<br>　　4.SKP2抑制剂可以显著抑制雄激素非依赖性细胞系的生长，并增强ADT的疗效。