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摘要目的：<br>　　自2014年EV-D68疫情爆发以来，EV-D68感染的全球流行率有所上升，危害公众健康。EV-D68主要感染下呼吸道，导致呼吸困难、喘息、肺炎和缺氧等症状。越来越多的证据表明，EV-D68感染与中枢神经系统并发症有关，导致急性弛缓性脊髓炎(acute flaccid myelitis, AFM)，这引起了全球的关注。然而，目前暂无有效的抗病毒药物或疫苗来控制EV-D68的传播。<br>　　先天免疫反应是抵御病毒感染的第一道防线。细胞模式识别受体（pattern recognition receptors，PRRs）检测病原微生物相关分子模式(pathogen associated molecular patterns，PAMPs)后，启动 IFN 的合成与释放。释放到细胞外的 IFN识别并结合特定的干扰素受体，通过 JAK-STAT 信号通路动员宿主细胞进入抗病毒状态。活化的STAT1转录复合物的核转运，增强了具有抗病毒功能的ISGs的表达。IFN 信号通路是宿主抵抗病毒入侵的重要防御机制，先前的研究表明， EV-D68通过多种策略阻断或削弱宿主细胞的免疫识别和 IFN产生，然而，EV-D68拮抗IFN信号转导的机制尚未完全阐明。<br>　　本研究的目的是通过研究 EV-D68 与 JAK-STAT 信号通路关键转导蛋白STAT1之间的作用，探究EV-D68阻断IFN-I信号转导的分子机制，鉴定EV-D68发挥关键作用的非结构蛋白，为开发抗肠道病毒药物提供新见解。<br>　　方法：<br>　　1.EV-D68感染对IFN-I信号转导的影响：<br>　　（1）EV-D68 Fermon、MO、KY 毒株感染转染 ISRE-Luc 表达质粒的HEK293T细胞，用 IFN-α处理细胞后进行荧光素酶活性测定，检测病毒感染对干扰素激活ISRE应答元件的影响。<br>　　（2）EV-D68感染A549细胞，通过免疫印迹检测病毒感染对IFN-I信号通路转导蛋白的影响。<br>　　（3）在不同细胞系中感染 EV-D68，进行免疫印迹检测 EV-D68 对内源性STAT1的作用。<br>　　2.EV-D68剪切STAT1的作用机制：<br>　　（1）EV-D68的非结构蛋白与STAT1进行共转染至HEK293T细胞，利用免疫印迹分析非结构蛋白与STAT1互作。<br>　　（2）EV-D68 3C 蛋白酶和 ISRE-Luc 表达质粒共转染至 HEK293T 细胞， IFN-α处理后进行荧光素酶活性测定EV-D68 3C蛋白酶对干扰素激活ISRE应答元件的影响。<br>　　（3）EV-D68 原始株3C蛋白酶表达质粒及原始株突变体3C蛋白酶表达质粒分别与STAT1表达质粒共转染至HEK293T细胞，免疫印迹检测STAT1剪切。<br>　　（4）EV-D68 野生型 3C 蛋白酶表达质粒与酶失活突变体表达质粒分别与STAT1表达质粒共转染至HEK293T细胞，免疫印迹检测STAT1剪切。<br>　　3.不同亚型肠道病毒3C蛋白酶对STAT1作用的保守性探究：<br>　　将不同亚型的肠道病毒 3C 蛋白酶的表达质粒与 STAT1 表达质粒共转染至HEK293T细胞，免疫印迹分析对比不同亚型肠道病毒对STAT1的作用。<br>　　4.EV-D68 3C蛋白酶抑制IFN-I信号转导的分子机制：<br>　　（1）应用Web Logo软件分析3C蛋白酶的剪切偏好，预测STAT1剪切位点，构建STAT1单点突变的表达质粒，与EV-D68 3C蛋白酶的表达质粒共转染至HEK293T细胞，免疫印迹分析3C蛋白酶剪切STAT1的位点。<br>　　（2）截短体 STAT1（132-750）表达质粒与全长 STAT1表达质粒分别转染至HEK293T细胞中，分别用IFN-α 或IFN-γ处理细胞后进行免疫荧光实验，分析3C蛋白酶剪切STAT1对STAT1核易位的影响。<br>　　（3）截短体STAT1对干扰素应答元件ISRE的影响：全长及截短体STAT1表达质粒分别与IRF9、STAT2以及ISRE-Luc进行共转染至HEK293T细胞，进行荧光素酶活性测定IFN应答元件ISRE的荧光素酶活性。<br>　　结果：<br>　　1.EV-D68感染介导STAT1的剪切，阻碍了IFN-α激活STAT1磷酸化进而抑制ISRE启动子的激活，并且这种作用在EV-D68 Fermon、MO、KY毒株中具有保守性。<br>　　2.EV-D68 3C蛋白酶依赖于其半胱氨酸蛋白酶活性介导STAT1的剪切。<br>　　3.肠道病毒对 STAT1 蛋白的剪切作用是不保守的：EV-D68 以及 poliovirus对STAT1能够进行有效剪切，而EV-A71，CV-A16， CV-B3以及Echovirus不能有效剪切STAT1。<br>　　4.EV-D68 3C蛋白酶在Q131残基处剪切STAT1蛋白抑制STAT1核易位，使其丧失了激活ISRE启动子的能力进一步阻断IFN-I信号转导。<br>　　结论：<br>　　1.EV-D68编码3C蛋白酶诱导STAT1剪切抑制IFN-I信号转导。<br>　　2.EV-D68 3C蛋白酶在Q131残基上剪切STAT1抑制其核易位，阻断JAK-STAT的激活。<br>　　3.不同亚型肠道病毒的3C蛋白酶对STAT1的剪切作用并不保守。