摘要研究目的:<br> 多发性硬化(multiplesclerosis,MS)是免疫介导的中枢神经系统(centralnervoussystem,CNS)炎性脱髓鞘疾病,是年轻人残疾的主要原因之一。B细胞耗竭治疗的成功经验提示B细胞和抗体在MS的发生和进展中起到重要作用,探寻相关免疫调节疗法具有重要科学意义和临床应用价值。<br> 浆细胞(plasmacells,PCs)及其前体浆母细胞(plasmablasts,PBs)是免疫系统中的关键成分,主要负责合成和分泌抗体,参与体液免疫反应。在MS及其经典动物模型实验性自身免疫性脑脊髓炎(experimentalautoimmuneencephalomyelitis,EAE)中,浆细胞和浆母细胞通过产生自身抗体参与致病,同时也可通过分泌细胞因子参与调控免疫激活和免疫耐受。因此,调控浆细胞/浆母细胞的分化和功能是MS/EAE的潜在治疗策略。程序性死亡受体-1(programmedcelldeathprotein1,PD-1)是一种免疫抑制性受体,广泛表达于T细胞、B细胞等各类免疫细胞表面。PD-1与其配体PD-L1相结合可以启动下级信号级联,负性调控免疫反应,其功能失调在MS/EAE的发病中发挥重要作用。已有研究表明,PD-L1治疗可以减轻EAE症状,但其具体作用及机制仍待探索。激活PD-1/PD-L1信号通路可调控MS/EAE中浆细胞分化及功能,诱导免疫耐受,目前尚无研究。<br> 本研究旨在探讨可溶性PD-L1(solubleprogrammedcelldeathligand1,sPD-L1)在EAE中对浆细胞和浆母细胞分化、细胞因子和抗体产生的调控作用,以期为MS的治疗提供新的策略和理论依据。<br> 研究方法:<br> (1)MOG35-55肽段和含灭活结核分支杆菌H37Ra的完全弗氏佐剂混合形成乳化剂,皮下注射于C57BL/6J雌性小鼠背部,随后腹腔注射百日咳毒素(PTX),48小时后再次腹腔注射PTX从而建立小鼠EAE模型。于免疫诱导当天开始每日监测小鼠的临床症状评分,直至发病高峰。开始发病时(免疫诱导第6天)EAE+sPD-L1组小鼠给予sPD-L1连续腹腔注射5天,对于EAE组小鼠,在上述相同时间点给予腹腔注射等体积生理盐水。<br> (2)在发病高峰期获取各组小鼠脊髓组织制作石蜡切片,进行苏木精-伊红染色和固蓝染色,观察脊髓炎性细胞浸润和脱髓鞘情况。<br> (3)于发病高峰期取小鼠脾脏,制备脾脏单细胞悬液,流式细胞术检测脾脏浆细胞(CD19-CD27hiCD138+)和浆母细胞(CD19+CD27hiCD138+)的比例,并检测浆细胞、浆母细胞中IL-6和IL-10的表达水平。<br> (4)于EAE发病高峰期取小鼠外周血,分离血清,酶联免疫吸附法检测血清中IgG和IgM的浓度。<br> 研究结果:<br> (1)给予雌性C57BL/6J小鼠MOG35-55肽段、完全弗氏佐剂和灭活结核分支杆菌H37Ra的混合乳液皮下注射,以及百日咳毒素腹腔注射,成功建立了EAE小鼠模型。<br> (2)sPD-L1治疗可以显著降低EAE小鼠的临床症状评分,减少EAE小鼠脊髓炎性细胞浸润,改善EAE小鼠脊髓脱髓鞘情况。<br> (3)与正常对照组相比,EAE组小鼠脾脏中浆细胞比例明显升高(P=0.001),EAE+sPD-L1治疗组小鼠脾脏浆细胞比例较EAE组明显降低(P=0.012<0.05)。正常对照组、EAE组、EAE+sPD-L1治疗组的脾脏浆母细胞比例无显著差异。<br> (4)EAE组和EAE+sPD-L1组脾脏浆细胞中表达IL-10的细胞比例均低于正常对照组(EAE组:Plt;0.0001;EAE+sPD-L1组:Plt;0.0001),而EAE组和EAE+sPD-L1组间无显著差异。正常对照组、EAE组、EAE+sPD-L1组脾脏浆细胞中表达IL-6的细胞比例无显著差异,浆母细胞中表达IL-6和IL-10的细胞比例无显著差异。<br> (5)与正常对照组相比,EAE组小鼠血清IgM和IgG水平均显著升高(IgM:P=0.01;IgG:P=0.03<0.05)。与EAE组相比,EAE+sPD-L1组小鼠血清中IgM水平显著下降(P=0.014<0.05),IgG水平无明显差异。<br> 结论:<br> (1)sPD-L1对EAE小鼠有显著治疗效果,可以改善神经功能损伤,改善脊髓组织炎性细胞浸润和脱髓鞘情况。<br> (2)在EAE小鼠体内,sPD-L1治疗可抑制脾脏浆细胞的分化。<br> (3)sPD-L1治疗对EAE小鼠脾脏浆细胞和浆母细胞IL-6和IL-10的产生无显著影响。<br> (4)sPD-L1治疗可降低EAE小鼠血清中IgM的分泌水平。
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