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摘要背景：<br>　　结直肠癌（Colorectalcancer，CRC）是我国常见的恶性肿瘤之一。近年来，我国结直肠癌发病率和死亡率均保持上升趋势。2020年中国癌症统计报告显示，我国结直肠癌发病率和死亡率在全部恶性肿瘤中分别位居第2和第5位。目前对结直肠癌患者的治疗手段以手术、放化疗为主，严重影响病人的生存质量。近年来，通过对结直肠癌发病机制的持续探索，多项研究已证实免疫系统与结直肠癌的发生、发展有密切关系，肿瘤细胞可通过遗传和表观遗传改变或者变异（抗原丢失或出现新抗原）来抵抗免疫系统的识别构成免疫活动。遗传与表观遗传的改变可形成肿瘤细胞新抗原及免疫微环境，肿瘤的免疫编辑使免疫细胞“无能”或难以发挥抗肿瘤作用，从而发展为肿瘤的免疫逃逸，故而大大影响了肿瘤的治疗效果。所以探究结直肠癌细胞免疫逃逸的分子机制对于肿瘤的治疗意义重大。<br>　　在肿瘤进展过程中，肿瘤相关巨噬细胞（Tumor-associatedmacrophages，TAMs）主要表现出M2型巨噬细胞的特点，通过促血管生成、抗炎及基质重塑等功能支持肿瘤的生长。通过分泌不同的生长因子，如：VEGF、PDGF、EGF、趋化因子以及细胞因子如IL-10、TGF-Β、CCL2、CXCL12等来发挥作用。此外，巨噬细胞能够分泌基质重塑分子如金属蛋白酶和组织蛋白酶等来帮助肿瘤侵袭，这些功能使巨噬细胞成为了新的抗肿瘤辅助治疗靶点。<br>　　粘膜相关上皮趋化因子(mucosalassociatedepithelialchemokine,CCL28)基因编码一种趋化因子，它在人体内的许多组织中都有表达。研究表明，CCL28与肿瘤的发生和发展密切相关。另一些研究表明，CCL28的表达水平与乳腺癌、结肠癌、胃癌等多种肿瘤的预后有关。此外，CCL28还可以通过影响免疫细胞的趋化和激活，参与肿瘤的免疫反应。研究表明，CCL28可以吸引多种免疫细胞，如T细胞、B细胞、自然杀伤细胞等，参与肿瘤的免疫反应。CCL28还可以促进树突状细胞的成熟和活化，增强其呈递抗原的能力，从而增强肿瘤的免疫反应。总之，CCL28基因可能在肿瘤的发生和发展中发挥一定的作用，但其具体机制还需要进一步研究。<br>　　含SAM尖端结构域的Ets转化特异性因子(SAMpointeddomaincontainingEtstranscriptionfactor,SPDEF)是一种转录因子，它在正常细胞中发挥重要的生物学功能，包括调节细胞分化、增殖和凋亡等过程。最近的研究表明，SPDEF在抑制癌症发生和发展中也发挥着重要的作用。SPDEF的表达水平在包括前列腺癌、肺癌、乳腺癌和结直肠癌等癌症中下调。此外，SPDEF的缺失还与肿瘤的侵袭性和预后不良相关。研究发现，SPDEF通过多种途径抑制癌症细胞的增殖和侵袭，包括抑制细胞周期进程、调节细胞凋亡、抑制细胞迁移和侵袭等。此外，SPDEF还可以抑制肿瘤干细胞的自我更新和增殖，从而减少肿瘤的复发和转移。因此，SPDEF被认为是一种潜在的抑癌基因，但其分子机制尚不清楚。<br>　　方法：<br>　　1.从TCGA数据库中COX回归分析筛选出18个可预测CRC患者预后的关键免疫相关基因（Immune-relatedgenes，IRGs），构建多因素预后风险模型，利用ROC曲线评估模型的准确性。<br>　　2.筛选出12个关键IRGs可能与CRC患者临床病理特征密切相关。在GEO数据库中WGCNA分析3个GEO芯片筛选出2个CRC基因共表达模块。将TCGA数据库与GEO数据库的IRGs求交集，获得5个关键IRGs。<br>　　3.选择CCL28做进一步分析，对CCL28基因的转录因子进行筛选，发现4个转录因子与CCL28存在共表达关系。结合科研结果和参考文献推测CCL28基因的转录因子为SPDEF。<br>　　4.在CRC临床样本中分析SPDEF与CCL28之间的关系及M2型巨噬细胞的表达情况。<br>　　5.体外实验验证SPDEF转录激活CCL28表达。<br>　　6.体外实验验证SPDEF上调CCL28表达抑制巨噬细胞M2型极化并抑制CRC细胞生长。<br>　　7.体内实验验证SPDEF可上调CCL28表达抑制巨噬细胞M2型极化并抑制CRC细胞在NOD-SCID小鼠体内成瘤。<br>　　结果：<br>　　1.COX回归分析筛选出18个可预测CRC患者预后的关键IRGs<br>　　（1）通过TCGA数据库，发现CRC样本中共有477个IRGs存在差异表达，其中297个IRGs下调，180个IRGs上调。<br>　　（2）单因素和多因素COX回归分析筛选出18个关键IRGs，其中12个与CRC患者的临床病理特征密切相关。<br>　　2.结合TCGA和GEO数据库CRC相关分析结果获的5个关键IRGs<br>　　（1）WGCNA分析3个GEO芯片筛选出2个CRC基因共表达模块。<br>　　（2）使用GEO数据库的数据集和TCGA数据库求交集，最终共发现有5个关键IRGs在GEO数据库得到验证（CCL28，ESM1，FABP4，STC2和VIP）。<br>　　3.CCL28可能通过SPDEF转录因子调控巨噬细胞浸润参与CRC细胞免疫逃逸<br>　　（1）肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）深度参与肿瘤的发生发展，免疫浸润分析结果显示，CRC细胞中CCL28可能通过影响巨噬细胞浸润参与CRC细胞免疫逃逸；选择CCL28用于后续分析。<br>　　（2）利用Cistrome网站获取肿瘤相关的转录因子，筛选出21个在CRC中差异表达的转录因子。相关性分析结果表明，CCL28与转录因子NR5A2、KLF4和SPDEF存在正调控关系，而与转录因子MYH11存在负调控关系。通过TCGA数据库及GEO数据库验证，并结合相关文献，推测SPDEF可能转录激活CCL28的表达。<br>　　4.CRC临床样本分析验证SPDEF与CCL28的表达情况<br>　　（1）通过RT-qPCR、WB及免疫组化对CRC临床样本分析：发现相对于癌旁正常组织，CRC肿瘤样本中，SPDEF和CCL28表达降低，巨噬细胞M2型极化升高。<br>　　5.经过体外实验验证，证实SPDEF可以转录激活CCL28的表达<br>　　（1）CHIP-qPCR结果显示SPDEF在CCL28启动子P1区域更高富集。<br>　　（2）双荧光素酶报告实验结果显示：过表达SPDEF后，CCL28-WT荧光素酶活性显著增加，而CCL28-MUT无显著变化。<br>　　（3）RT-qPCR检测显示，在CT26和HCT-116细胞中高表达SPDEF基因，SPDEF和CCL28表达均增加，而干扰CCL28后则可以逆转过表达SPDEF对CCL28的促进作用。<br>　　6.经体外实验验证，过表达SPDEF可上调CCL28表达抑制巨噬细胞M2型极化，从而抑制CRC细胞生长，而干扰CCL28后则可逆转过表达SPDEF的作用。<br>　　（1）RT-qPCR、WB、ElISA及流式细胞术检测结果提示SPDEF可上调CCL28amp;nbsp;表达抑制巨噬细胞M2型极化。<br>　　（2）CCK8实验、Transwell实验及流式细胞术检测结果提示SPDEF可上调CCL28表达抑制巨噬细胞M2型极化，从而抑制CRC细胞生长。<br>　　7.经体内实验验证SPDEF可上调CCL28表达抑制巨噬细胞M2型极化并抑制CRC细胞在NOD-SCID小鼠体内成瘤<br>　　（1）构建NOD-SCID小鼠的皮下移植瘤模型，发现与oe-NC组相比，oe-SPDEF组小鼠肿瘤生长减慢，肿瘤重量减少，而与oe-SPDEF组相比，oe-SPDEF+sh-CCL28组肿瘤生长和肿瘤重量增加。<br>　　（2）使用RT-qPCR、WB、免疫组化及ElISA检测瘤体组织中IL-10、Arg-1、SPDEF、CCL28以及CD163的mRNA和蛋白表达，证实SPDEF可上调CCL28表达抑制巨噬细胞M2型极化并抑制CRC细胞在NOD-SCID小鼠体内成瘤。<br>　　结论：<br>　　1．在生信分析中，筛选出18个关键IRGs，其中12个与CRC患者的临床病理特征密切相关。筛选出CCL28等5个IRGs可能参与CRC细胞免疫逃逸。构建预后风险模型，利用ROC曲线评估模型的准确性。<br>　　2．通过对CRC临床样本的分析以及体外实验验证了SPDEF可转录激活CCL28表达。<br>　　3．通过体内体外实验验证了SPDEF可转录激活CCL28表达，抑制巨噬细胞M2型极化，阻止CRC细胞的免疫逃逸。为CRC的免疫治疗提供新的思路和潜在的治疗靶点。