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摘要甲状腺眼病（TED）是一种严重进行性、威胁视力的自身免疫性疾病，当前主要治疗方式为药物治疗和手术治疗。而常用的一线药物糖皮质激素可能会引发多种副作用。基于此，已有对于TED治疗的免疫靶向药物的研究，通过阻断IGF1R靶点来减轻该疾病所带来的痛苦。近年来，靶向药物研究中的抗体治疗已得到社会的认可，并且已有多种药物上市，且关于TED疾病的作用机制研究也在进行，研究表明，胰岛素样生长因子-1受体（IGF1R）在TED患者的OFs、T细胞和B细胞均检测到具有较高的表达，并已有靶向抗IGF1R抗体用于治疗TED。但传统的单克隆抗体制备过程繁琐，人源化过程复杂。因此，本课题开发了具有优良阻断效力的靶向IGF1R的单域抗体，一方面解决现有上市和临床中药物对IGF1-IGF1R阻断不彻底的问题，为患者提供更好的应答和疗效，解决现在仍未被满足的临床需求；另一方面旨在利用单域抗体溶解度高、热稳定性好、表达量高、生产成本低的先天优势，开发更高浓度的皮下注射制剂，结合分子本身更高的亲和力和阻断效力，从而有效延长注射间隔，提高给药便利性，降低患者治疗负担，为治疗TED的新药物的研发奠定基础。主要研究内容包括：<br>　　1. 噬菌体文库的构建<br>　　使用重组人IGF1R蛋白对健康羊驼进行免疫，通过细胞分离，提取淋巴细胞中总RNA进行扩增为cDNA和巢式PCR等方法将单域抗体核酸序列与噬菌体进行连接，构建抗IGF1R单域抗体的噬菌体文库的库容为2.4×109 cfu，菌落PCR表明单域抗体基因正确插入率约为98%，而且文库的多样性良好。<br>　　2. 抗IGF1R单域抗体的筛选<br>　　采用固相亲和筛选法进行三轮筛选，其包被量分别为500 ng、200 ng、50 ng，筛选后得到富集特异性结合的噬菌体，进行菌液ELISA和序列分析，共筛选得到11条靶向抗IGF1R的单域抗体的独特序列。<br>　　3. 抗IGF1R单域抗体的制备及验证<br>　　对上述11条独特序列进行快速原核表达后制备单域抗体的表达粗提物，并通过功能ELISA筛选得到9条（1B5/4C2/5A7/4H5/5C1/6G5/2D1/4F8/6F4）具有与IGF1R蛋白结合的活性，其中有3条（4C2/5A7/6G5）具有初步阻断IGF1-IGF1R功能的序列。<br>　　4. 抗IGF1R单域抗体融合蛋白的制备及生物学研究<br>　　进一步对3条具有阻断IGF1-IGF1R功能序列构建为IgG进行真核瞬时转染和纯化，结果表明制备得到的融合蛋白具有很高的纯度，然后通过阻断ELISA法确认其对IGF1/IGF2-IGF1R的阻断活力及与不同种属的结合情况，结果表明5A7-Fc、6G5-Fc具有更优的阻断效力，而且也可与人IGF1R-his和猴IGF1R-his进行结合。<br>　　5. 人源化单域抗体的制备及生物学研究<br>　　人源化是使用了表面氨基酸人源化法和VHH人源化通用框架移植法相结合的方法。选取5A7-Fc、6G5-Fc优效克隆进行人源化设计，并对得到的人源化分子进行阻断 ELISA、分子结合动力学、细胞增殖抑制等一系列检测实验，结果表明5A7-hz4-Fc的阻断效力最好。<br>　　综上，本课题成功制备了抗IGF1R单域抗体。该抗体的制备使用的是噬菌体展示技术，制备方法较为简便，而且单域抗体也具有稳定性好、溶解度高等特点。在肿瘤细胞实验中该抗体显示出具有比阳性对照更优的阻断效果。因此，制备得到的单域抗体具有作为治疗甲状腺眼病治疗药物的潜能。