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摘要目的：<br>　　近年来，新一代测序技术飞速发展，肠道菌群越来越受到研究者关注，在疾病诊断和治疗中提供了新的思路和可能性。肠道菌群及其代谢产物作为 2 型糖尿病（Type 2 Diabetes Mellitus，T2DM）和糖尿病肾病（Diabetic Ki dney Disease，DKD）重要的影响因素，在疾病的发生发展中起到了重要作用，对其深入研究，有可能在 T2DM 转化为DKD的过程中发现新的诊断与治疗的靶点。本次研究基于宏基因测序技术，分析T2DM患者、早期DKD患者、中期DKD患者与健康人群在肠道菌群组成、结构、功能和代谢产物短链脂肪酸（Short Chain Fatty Acids, SCFAs）上的差异。通过寻找特征性微生物分类群，一方面能够给DKD的早期诊断提供新的指导思路，同时还能在肠道微生物角度探索DKD的发病和致病机制，对后续针对性地开展饮食或药物干预，纠正患者肠道菌群的异常状态，缓解疾病的发展，提高治疗效果提供理论依据。<br>　　方法：<br>　　本研究自2022年1月至2022年8月，依托江苏省涟水县人民医院陆续招募T2DM患者（T2DM组）、早期DKD患者（DKD_E组）、中期DKD患者（DKD组）和健康对照组人群（HC组），每组各40人，总计160人。主要采集受试者的粪便样本进行肠道菌群宏基因组测序和肠道 SCFAs 的测定。在提取粪便 DNA 和样本前处理后，使用DNBSEQ 测序平台进行肠道菌群宏基因组测序。下机的 Raw Reads 通过去除低质量读数和去宿主序列两个步骤完成质量控制，得到用于分析的 Clean Reads。随后使用MetaPhlAn4 软件分析菌群的丰度与组成，得到不同分类学水平（门、纲、目、科、属、种）上的信息。用 Simpson 和 Shannon 指数描述 α 多样性，基于 Bray-curtis 距离的差异进行β 多样性的计算。功能注释使用 HUMAnN3 软件，获得来自 UniProt Reference Cluster 的基因家族和 MetaCyc 数据库中代谢通路水平上的相对丰度。采用二元Logistic 回归和受试者工作特征曲线（Receiver Operating Characteristic，ROC）来评估潜在菌群标志物模型的预测能力。肠道代谢产物SCFAs则运用气相色谱-质谱联用法进行定量检测。测定的SCFAs包括乙酸、丁酸、丙酸、戊酸、己酸、异丁酸和异戊酸七种。采用主成分分析（Principal Component Analysis，PCA）和正交偏最小二乘法判别分析（Orthogonal Partial Least Squares-Discriminant Analysis，OPLS-DA）评估 SCFAs 分布差异。使用 Kruskal-Wallis 检验进行多组间差异分析，两组间比较使用 Wilcoxon rank-sum检验进行。相关性分析通过计算参数之间的 Spearman 相关系数与双尾显著性检验。统计显著性设为P＜0.05。<br>　　结果：<br>　　（1）临床指标情况：<br>　　四组受试者在年龄、性别和BMI上不存在显著差异（P＞0.05）。T2DM组、DKD_E组与 DKD 组的空腹血糖和糖化血红蛋白均显著高于 HC 组（P＜0.01）。DKD_E 组与DKD组的甘油三酯和尿微量白蛋白/尿肌酐比值显著高于HC组（P＜0.01）。DKD_E组的舒张压、收缩压和血肌酐也显著高于HC组（P＜0.01）。DKD_E组和DKD组的病程时间显著长于T2DM组（P＜0.01）。<br>　　（2）肠道菌群变化：<br>　　DKD组肠道菌群多样性显著低于T2DM组和HC组，菌群的结构分布也与T2DM组和HC组存在差异（P＜0.05）。<br>　　DKD组的拟杆菌门（Bacteroidetes）相对丰度显著低于其他三组（P＜0.05），同时放线菌门（Actinobacteria）相对丰度显著高于其他三组（P＜0.01）。DKD 组的厚壁菌门（Firmicutes）相对丰度显著高于T2DM组（P=0.04）和HC组（P＜0.01）。<br>　　DKD 组中相对丰度显著高于其他三组（ P＜0.05 ）的物种有：双歧杆菌属（Bifidobacterium）、梭菌属（Clostridium, 主要菌种为柔嫩梭菌 Clostridium_leptum 、Clostridium_sp_CAG_ 299 菌和 Clostridium_sp_CAG_58 菌）、柯林斯氏菌属（Collinsella, 主要菌种为产气柯林斯氏菌Collinsella_aerofaciens）、艾森贝格氏菌属（Eisenbergiella, 主要菌种为泰氏艾森贝格氏菌 Eisenbergiella_tayi）、俄罗斯杆菌属（Ruthenibacterium, 主要菌种为产乳酸俄罗斯杆菌 Ruthenibacterium_lactatiformans ）、爱格士氏菌属（Eggerthella, 主要菌种为缓慢爱格士氏菌 Eggerthella_lenta）、阿德勒氏菌属（Adlercreutzia, 主要菌种为产雌马阿德勒氏菌 Adlercreutzia_equolifaciens）和戈登氏杆菌属(Gordonibacter, 主要菌种为帕氏戈登氏杆菌 Gordonibacter_pamelaeae)；相对丰度显著降低（P＜0.05）的有拟杆菌属（Bacteroides , 主要菌种为平常拟杆菌Bacteroides_plebeius）。<br>　　DKD_E 组和 DKD 组的韦荣氏球菌属（Veillonella）和多尔氏菌属（Dorea, 主要菌种为长链多尔氏菌Dorea_longicatena和产甲酸多尔氏菌Dorea_formicigenerans）的相对丰度显著高于HC组。相对丰度仅表现为DKD组高于HC组（P＜0.05）的有：瘤胃球菌属（Ruminococcus）、Lachnoclostridium菌属、颤螺菌属（Oscillibacter）、巨球形菌属（Megasphaera）和嗜胆菌属（Bilophila）。仅表现为DKD组低于HC组的为罗斯拜瑞氏菌属(Roseburia，P=0.04)。<br>　　T2DM组的布劳特氏菌属（Blautia）的相对丰度显著低于HC组（P＜0.01），巨球形菌属（Megasphaera）的相对丰度则显著高于HC组（P=0.04）。<br>　　（3）短链脂肪酸差异：<br>　　DKD 组的乙酸（P=0.04）和丙酸（P＜0.01）含量显著低于 T2DM 组（P=0.04）。DKD组的己酸（P＜0.001）、戊酸（P＜0.01）、异丁酸（P＜0.01）和异戊酸（P＜0.001）含量显著高于HC组，乙酸（P＜0.01）和丙酸（P=0.04）含量则显著低于HC组。DKD组的己酸（P＜0.001）和异戊酸（P=0.04）含量也显著高于DKD_E组，乙酸（P＜0.01）含量则显著低于DKD_E组。T2DM组的异丁酸（P=0.04）含量显著高于HC组。<br>　　（4）代谢通路差异：<br>　　DKD 组的辅酶/载体/维生素合成通路和次级代谢物合成通路表达显著低于其他三组（P＜0.05），生物发酵通路和三羧酸循环通路表达则显著高于其他三组（P＜0.05）。DKD_E组和DKD组的四吡咯化合物合成通路表达显著低于HC组（P＜0.05）。T2DM组、DKD_E组和DKD组的磷酸戊糖途径表达显著高于HC组（P＜0.05）。<br>　　结论：<br>　　通过对T2DM患者、早期DKD患者、中期DKD患者和健康对照人群的肠道菌群进行宏基因组测序和SCFAs 检测。本研究发现 T2DM 患者和早期 DKD 患者的肠道菌群表现为轻微失衡，而中期DKD患者肠道菌群的多样性会出现降低，菌群的结构也会产生变化，在诸多物种、产物及代谢通路上与其他三组存在差异。在中期DKD患者肠道内主要富集的细菌有瘤胃球菌、双歧杆菌、柯林斯氏菌、梭菌、多尔氏菌、俄罗斯杆菌、艾森贝格氏菌、爱格士氏菌、阿德勒氏菌和戈登氏杆菌；主要减少的有拟杆菌和罗斯拜瑞氏菌。中期DKD患者肠道内主要富集的SCFAs有异丁酸、异戊酸和己酸；主要减少的有乙酸和丙酸。中期DKD患者肠道菌群相关代谢通路表达增加的有生物发酵通路、三羧酸循环通路和磷酸戊糖途径；表达减少的有辅酶/载体/维生素合成通路、次级代谢物合成通路和四吡咯化合物合成通路。使用阿德勒氏菌、柯林斯氏菌、多尔氏菌、爱格士氏菌、艾森贝格氏菌、亨盖特氏菌和俄罗斯杆菌构建的菌群标志物预测模型具有鉴别中期DKD的能力。