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摘要目的：<br>　　硼替佐米（Bortezomib，BTZ）作为多发性骨髓瘤（Multiple myeloma，MM）经典化疗药物，与免疫调节药物（Immunomodulatory drugs，IMiDs）、地塞米松等多种不同类型的药物联合搭配可明显改善MM患者的现状。青蒿琥酯（Artesunate，ART）是疟疾治疗领域最常见的药物之一。近年来，大量研究着眼于ART在单独或与抗癌药物联合使用的基础上对肿瘤细胞的杀伤效果，总体来说，ART对癌症患者的治疗管理可发挥积极作用。尤其在血液学方面，ART的加入可以极大程度上克服MM患者用药过程中出现的获得性耐药。然而具体到药物本身，ART能否有效提高BTZ抗MM特性尚未清晰。因此，本课题研究ART和BTZ联合作用于MM细胞一定时间后对肿瘤细胞的凋亡、细胞周期等生物学行为的影响，探求药物联合应用潜在的作用机制，为BTZ在临床上联合治疗提供新思路。<br>　　方法：<br>　　1.ART联合BTZ作用对RPMI-8226细胞及U266细胞的增殖抑制作用<br>　　使用不同浓度的ART和BTZ单独或联合处理人MM细胞RPMI-8226和U266一定时间，选择细胞计数试剂盒-8（Cell counting kit-8，CCK-8）测定药物对细胞的增殖抑制程度，依据CCK-8法测出的光密度（Optical density，OD）值进行相关数据计算，以此结果判断ART和BTZ联合用药的药物相关作用类型。<br>　　2.ART联合BTZ作用对RPMI-8226细胞及U266细胞凋亡率和细胞周期的影响<br>　　在根据CCK-8法基础上确定BTZ和ART单独或联合作用方式，选用FCM检测不同药物浓度作用下对RPMI-8226细胞及U266细胞作用48 h后的细胞凋亡率及细胞周期的影响。3.ART联合BTZ作用对RPMI-8226细胞和U266细胞的相关mRNA变化的影响<br>　　定量实时PCR （ Quantitative real-time PCR ， qRT-PCR ）法检测ART与BTZ作用于RPMI-8226 细胞及 U266细胞48 h后，对细胞的 Ki67、B淋巴细胞瘤-2 基因（ B-cell lymphoma-2，BCL-2）、Cyclin B1与BCL-2关联X蛋白（BCL-2-associated X protein，BAX）基因的转录水平的影响。<br>　　4.ART联合BTZ作用对RPMI-8226细胞及U266细胞的相关蛋白表达变化的影响<br>　　蛋白免疫印迹法（Western Blot, WB）检测ART与BTZ作用于RPMI-8226细胞及U266细胞48 h后，对细胞的Ki67、BCL-2、BAX与Cyclin B1蛋白表达水平的影响。<br>　　5.ART联合BTZ作用对RPMI-8226细胞及U266细胞PI3K/AKT通路相关蛋白表达的影响<br>　　WB法检测ART与BTZ联合作用于RPMI-8226细胞及U266细胞48 h后，对细胞的磷酸肌醇3-激酶（Phosphoinositide 3-kinase，PI3K）、磷酸化磷酸肌醇3激酶（Phosphorylation phosphoinositide 3-kinase，p-PI3K）、蛋白激酶B（Protein kinase B，AKT）、磷酸化蛋白激酶B（Phosphorylated protein kinase B，p-AKT）蛋白表达水平的影响。<br>　　结果：<br>　　1. ART联合BTZ作用对RPMI-8226细胞及U266细胞的增殖抑制作用<br>　　使用不同浓度的ART和BTZ单独或联合处理人MM细胞RPMI-8226和U266 24 h，48 h及72 h后，CCK-8法发现ART和BTZ单独或联合处理RPMI-8226细胞和U266细胞均能抑制细胞的增殖，且呈现浓度依赖性（P＜0.05）及时间依赖性（P＜0.05）。此外，两种药物联合作用后，可在RPMI-8226细胞和U266细胞中均呈现出协同抑制作用（P＜0.05）。<br>　　2. ART联合BTZ作用对RPMI-8226细胞及U266细胞凋亡率及细胞周期的影响<br>　　FCM法测定ART与BTZ联合作用于RPMI-8226细胞及U266细胞作用48 h后细胞凋亡率及细胞周期变化情况。与ART或BTZ单独组相比，实验组（ART联合BTZ组）细胞凋亡率明显升高（P＜0.05），并出现G2/M细胞周期停滞（P＜0.05）。<br>　　3. ART联合BTZ作用对RPMI-8226细胞及U266细胞的相关基因mRNA变化的影响<br>　　ART与BTZ联合作用于RPMI-8226细胞及U266细胞作用48 h后，与单药对照组相比，实验组BAX mRNA水平上调最为明显（P＜0.05），同时Ki67、BCL-2、Cyclin B1 mRNA水平下调最为明显（P＜0.05）。<br>　　4. ART联合BTZ作用对RPMI-8226细胞及U266细胞的相关蛋白表达变化的影响<br>　　ART与BTZ联合作用于RPMI-8226细胞及U266细胞作用48 h，与单药对照组相比，实验组BAX蛋白表达上调最为明显（P＜0.05），同时Ki67、BCL-2、Cyclin B1蛋白表达下调最为明显（P＜0.05）。<br>　　5. ART联合BTZ作用对RPMI-8226细胞及U266细胞PI3K/AKT通路相关蛋白表达的影响<br>　　ART与BTZ联合作用于RPMI-8226细胞及U266细胞作用48 h后，与单药对照组相比，实验组p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT比值明显降低（P＜0.05）。<br>　　结论：<br>　　1. ART和BTZ均能在一定时间段的特定浓度范围内抑制人MM细胞RPMI-8226及U266的增殖，并均表现出协同抑制作用。<br>　　2. ART与BTZ单独或联合作用于RPMI-8226细胞及U266细胞，可诱导G2/M期周期阻滞和细胞凋亡率增加，且联合诱导作用的细胞凋亡率及G2/M百分率较ART或BTZ单独用药结果更明显。ART联合BTZ可促进BAX表达上调及Ki67、BCL-2和Cyclin B1表达下调。<br>　　3. PI3K/AKT信号通路参与ART联合BTZ协同诱导RPMI-8226和U266细胞凋亡过程。<br>　　4. ART与BTZ的组合用药可为MM患者的治疗提供一种新的个体化方案。