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摘要近年来，放射治疗取得了突破性进展，甚至成为胃肠道肿瘤患者综合治疗的重要手段。多学科综合治疗成为当前改善肿瘤免疫逃逸，发挥协同增效的有效方案。然而放疗抵抗及其不良反应的存在使得传统放射治疗的协同效应没有达到预期效果。在此背景下，碳离子因其具有更精确的布拉格峰型深度-剂量分布和优越的生物学效应成为理想的放疗粒子。放疗抵抗与肿瘤微环境改变相关，且重塑肿瘤微环境可改善放疗抵抗。因此，有必要进一步了解碳离子放疗（CIRT）对肿瘤微环境的影响及机制，探索增强CIRT敏感性的新途径。<br>　　目的：（1）明确晚期胃癌患者是否可以从放疗中获益以及获益程度。（2）明确 CIRT重塑免疫微环境；（3）明确 CIRT激活 cGAS-STING-TBK1-IRF3通路，且调节 TME 中 CD8+T 细胞的浸润、细胞毒性功能和肿瘤相关巨噬细胞（TAM）极化；（4）明确 CIRT 诱导免疫原性细胞死亡，与 STING 激动剂diABZI联合发挥协同增敏效应及其机制；（5）明确CIRT后CD8+T细胞与TAM的细胞间通讯。<br>　　方法：（1）采用SEER数据库进行回顾性分析。采用单因素/多因素Cox回归分析来确定OS和CSS的预后因素。构建列线图来预测胃癌患者1年、3年和5年的OS和CSS。（2）基于scRNA-seq结果构建CIRT后的免疫微环境图景，并利用流式细胞术验证 CIRT后 CD8+T细胞与 TAM的浸润水平和功能改变。（3）基于 scRNA-seq 和生信分析筛选出 CIRT后的不同类型细胞差异表达基因显著富集的通路，并通过WB验证CIRT后cGAS-STING-TBK1-IRF3通路分子的表达；（4）将 MFC（胃癌细胞）、CT26（结直肠癌细胞） 荷瘤模型分为对照组、CIRT组、diABZI（STING激动剂）组和CIRT联合diABZI组，观察模型小鼠的生存状态及肿瘤变化。利用流式细胞术分析各组肿瘤中 CD8+T 细胞、TAM的浸润和功能差异；（6）利用 RNA-seq 和生物信息学分析及免疫组化，分析CIRT 后胃癌和结直肠癌免疫原性死亡相关基因的表达、预后及免疫相关性。利用流式细胞术分析树突状细胞与 TAM 的 MHCⅡ分子表达；（7）构建 Balb/c-nu荷瘤模型，进行CIRT干预, 观察Balb/c-nu的肿瘤变化，利用流式细胞分析TAM极化差异。<br>　　结果：（1）我们的 OS研究共纳入 2646例患者。年龄、原发部位、病理分级、AJCC 6th_TNM 分期、化疗、放疗和所检查的区域淋巴结数量被确定为晚期 GAC 患者 OS 的预后因素（P ＜ 0.05）。我们的 CSS 研究共纳入了 2369 例患者。年龄、原发部位、病理分级、AJCC 6th_TNM 分期、化疗、放疗和所检查的区域淋巴结数量是 CSS 的危险因素（P ＜ 0.05）。利用这些因素构建列线图以预测晚期GAC患者的1年、3年、5年的OS和CSS。（2）通过分析CIRT组和对照组各类细胞数量和比例，我们发现肿瘤细胞、CD8+T细胞、TAM是肿瘤组织中占比最高的细胞类型。经 CIRT 干预后，肿瘤细胞、成纤维细胞减少，而CD8+T细胞、CD4+T 细胞、TAM、中性粒细胞、Treg细胞、树突状细胞、NK细胞浸润增加。以下 10 个细胞簇的主要标记基因分别是：Treg 细胞（Foxp3、Tnfrsf4、Tnfrsf18和Ctla4）,浆细胞样树突状细胞（Siglech、Klk1和Cox6a2）、NK 细胞（Klra7、Ncr1 和 Gzma）、中性粒细胞（Cxcl2、S100a8 和 S100a9）、TAM(C1qa、C1qb、Apoe和H2-Eb1)、成纤维细胞（Col3a1、Col1a2和Col1a1）、树突状细胞（H2-Eb1、Mgl2和Ifitm1）、CD8+T细胞（Cd3g、Gzmb和Nkg7）、CD4+T 细胞（Cd3g、Gzmb、Nkg7、Tnfrsf18、Ctla4 和 Tnfrsf4）、肿瘤细胞（Mt1、Cd63和 Spp1）。（3）基于 scRNA-seq 数据的通路富集分析，发现CIRT后胃癌细胞中差异表达基因主要富集在DNA损伤修复及细胞周期相关通路，而CD8+T细胞、TAM和树突状细胞的差异表达基因显著富集在炎症趋化相关通路。对于免疫细胞浸润水平，在 615小鼠胃癌模型及 Balb/c小鼠结肠癌模型中，与对照组相比，CIRT组和diABZI组CD8+T细胞和TAM的浸润均显著增加；与CIRT相比，CIRT联合 diABZI可显著增加 CD8+T细胞和 TAM的浸润。对于CD8+T细胞功能，与对照组相比，CIRT组GZMB+和IFN-γ+CD8+T细胞比例显著增加，但同时也促进了 PD1+和 CD39+CD8+T 细胞的浸润。二联组相比于CIRT组CD8+T细胞的肿瘤杀伤功能明显增强，但也显著促进CD8+T的耗竭。对于 TAM，CIRT 相比于对照组，TAM 浸润增加的同时，并向 M1 方向极化。二联组相比于 CIRT，促进 TAM浸润和 M1极化作用更强。就肿瘤生长抑制作用而言，diABZI抑瘤作用最弱，CIRT次之，二联可显著抑制肿瘤生长。（4）生物信息学分析结果表明放疗后免疫原性死亡相关分子 HMGB1和 CALR的表达增加。构建免疫原性死亡相关分子集合进行生物信息学分析发现，免疫原性死亡相关分子高表达与较好的预后相关。通过 TIME、xCELL、EPIC 等免疫浸润分析法，我们发现免疫原性死亡相关分子集合的高表达与多种免疫细胞的富集相关，如 CD8+T细胞、TAM、NK细胞等。免疫组化验证 CIRT可促进胃癌和结肠癌中HMGB1和CALR分子的表达。流式细胞术验证CIRT后树突状细胞和TAM的MHCⅡ分子表达增加；（5）基于CIRT组scRNA-seq数据的细胞间通讯分析，我们发现 TAM和 CD8+T细胞在肿瘤微环境细胞间通讯中居于主导地位。TAM主要受CSF-1、IFN-γ和C3这三个传入信号的影响。其中C3信号主要来源于 TAM的自分泌，CD8+T细胞是 IFN-γ最主要的来源，肿瘤细胞和 CD8+T细胞均可分泌CSF-1。CD8+T细胞与TAM关系密切，CD8+T细胞可通过CSF-1/CSF-1R和IFN-γ/IFN-γR信号通路与TAM相联系。在免疫缺陷的Balb/c-nu荷瘤小鼠模型中CIRT组与对照组相比，TAM浸润和极化未观察到显著差异。<br>　　结论：（1）年龄、原发部位、病理分级、AJCC 6th_TNM 分期、化疗、放疗和所检查的区域淋巴结数量是晚期胃癌患者OS和CSS的独立危险因素。（2） CIRT可增强CD8+T细胞和TAM浸润及功能，且CIRT+diABZI可发挥协同抗肿瘤作用。（3）CIRT 可能通过诱导免疫原性死亡促进肿瘤免疫循环，进而促进与diABZI协同增效作用。（4）CIRT诱导 M1样巨噬细胞极化可能依赖CD8+T细胞的激活。