检索历史 清除

摘要目的：<br>　　探讨IRTKS和BAIAP2L2对肝癌细胞生物学功能的影响，阐明IRTKS在肝癌进展中的作用及分子机制，为理解肝癌的发生发展提供新思路，也为肝癌的治疗提供新方向。<br>　　方法：<br>　　1、基于癌症基因组图谱（The Cancer Genome Atlas，TCGA）、国际癌症基因组联盟（International Cancer Genome Consortium，ICGC），基因表达总库（Gene Expression Omnibus，GEO）和人类蛋白图谱（Human Protein Atlas，HPA）数据库分析IRTKS和BAIAP2L2在肝癌中的表达，通过组织芯片和肝癌细胞对IRTKS的表达进行验证，同时进行肝癌患者的预后和临床病理特征的相关性分析。使用公共生物信息学数据库分析IRTKS和BAIAP2L2在甲基化、免疫浸润、药物敏感性方面的潜在作用。<br>　　2、使用化学合成的siRNA敲低IRTKS，使用过表达质粒上调IRTKS，通过CCK8、克隆形成、划痕和Transwell实验探究IRTKS对肝癌细胞增殖、迁移和侵袭能力的影响。使用慢病毒上调或下调IRTKS后建立裸鼠尾静脉注射肺转移模型，探究IRTKS在体内对肝癌细胞转移能力的影响。<br>　　3、通过文献调研和分子对接寻找IRTKS的互作蛋白（SHIP2和PTEN），并通过免疫荧光和免疫共沉淀（co-immunoprecipitation，Co-IP）实验验证内源性蛋白互作。构建GST-IRTKS全长、截短体及突变体片段质粒，通过GST融合蛋白沉降（GST-pull down）实验确定IRTKS与SHIP2或者PTEN结合的区域。通过蛋白质免疫印记（Western blot，WB）实验探究IRTKS与SHIP2和PTEN表达的相关性。在肝癌细胞中过表达IRTKS，同时上调SHIP2或者PTEN，利用CCK8、克隆形成、划痕和Transwell实验探究肝癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力的变化。构建IRTKS的SH3结构域缺失突变体，通过CCK8、克隆形成、划痕、Transwell实验以及构建裸鼠皮下成瘤和尾静脉注射肺转移模型证实IRTKS的SH3结构域发挥促癌作用。通过基因集富集分析（Gene Set Enrichment Analysis，GSEA）预测IRTKS调控的信号通路，WB实验探究IRTKS对Akt/GSK3β/Snail1通路关键分子的调控。在肝癌细胞中过表达、敲低IRTKS后加入放线菌酮（Cycloheximide，CHX）或者MG132，通过WB实验分析SHIP2、PTEN和Snail1的降解或者表达情况。<br>　　结果：<br>　　1、IRTKS和BAIAP2L2在肝癌中的多组学分析：基于生物信息学及分子生物学实验发现IRTKS和BAIAP2L2在肝癌细胞和组织中高表达，并且与肝癌预后不良相关。IRTKS在肝癌细胞及组织中高表达，IRTKS的表达与AJCC3-4期相关。此外，IRTKS高表达的肝癌患者总生存期（Overall survival，OS）较差，IRTKS是肝癌的独立预后因素。IRTKS的3个甲基化位点（cg07830472，cg27013914，cg23043780）与肝癌预后不良有关。BAIAP2L2的2个甲基化位点（cg27505627，cg09247692）与肝癌预后不良有关。通过免疫浸润分析发现IRTKS表达与CD4+T细胞、巨噬细胞、B细胞、中性粒细胞和树突状细胞（Dendritic cell，DC）的浸润显著正相关，并且CD4+T细胞、巨噬细胞和中性粒细胞浸润程度高的肝癌患者2年OS差。BAIAP2L2的表达与Cytotoxic cells，DC，中性粒细胞，CD56dim自然杀伤细胞，中央记忆型T细胞（Central Memory T cell，Tcm），伽马三角洲T细胞（Gamma delta T cells，Tgd）和辅助性T细胞17（T helper cell17，Th17）细胞的免疫浸润负相关，与CD56明亮自然杀伤细胞，滤泡辅助性T细胞（Follicular helper T cell，TFH）和辅助型T细胞2（T helper2cell，Th2）的免疫浸润正相关。通过CellMiner数据库发现IRTKS的表达与Cobimetinib，Trametinib，ARRY-162的敏感性正相关，BAIAP2L2高表达对7种药物（Dabrafenib，Vemurafenib，Encorafenib，Selumetinib，Cobimetinib，Trametinib和ARRY?162）有更好的敏感性，而BAIAP2L2高表达与7种药物（Mitoxantrone，MITOXANTRONE，Daunorubicin，Valrubicin，Epirubicin,Doxorubicin和Teniposide）的抗性增加有关。<br>　　2、IRTKS对肝癌细胞生物学行为的影响：细胞实验表明下调IRTKS抑制肝癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力，上调IRTKS出现相反的效应。动物实验表明下调IRTKS抑制裸鼠体内肝癌细胞肺转移的能力，上调IRTKS出现相反的效应。<br>　　3、IRTKS介导SHIP2发挥促癌作用：GSEA富集分析显示IRTKS与细胞粘附、细胞周期及PI3K/Akt通路相关。文献调研发现SHIP2和PTEN是Akt上游信号传导分子。免疫荧光发现IRTKS与SHIP2和PTEN在肝癌细胞中共定位，Co-IP表明三者间存在内源性相互作用。CCK8、克隆形成、划痕和Transwell实验表明SHIP2和PTEN能逆转IRTKS促进肝癌细胞增殖、迁移和侵袭的能力。GST-pull down实验证实IRTKS的SH3结构域是与SHIP2结合的主要区段，IRTKS的IMD结构域是与PTEN结合的主要区段。通过CCK8、克隆形成、划痕和Transwell实验发现IRTKS的SH3结构域缺失突变后，IRTKS促进肝癌细胞的增殖、迁移和侵袭的能力消失。通过WB实验发现在肝癌细胞中下调IRTKS后加入CHX，6h内Snail1降解增快，但是上调IRTKS后加入CHX，6h内Snail1降解减慢。WB实验发现在肝癌细胞中过表达IRTKS后加入MG132，Snail1的表达增强，SHIP2和PTEN表达减弱。<br>　　结论：<br>　　1.IRTKS和BAIAP2L2在肝癌中高表达，与肝癌患者的不良预后相关;<br>　　2.IRTKS促进肝癌的生长和转移，其SH3结构域是促进肝癌生长和转移的主要区域；<br>　　3.SHIP2和PTEN能逆转IRTKS的促癌作用；<br>　　4.IRTKS可能介导SHIP2调控Akt/GSK3β/snail1通路促进肝癌的EMT。