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摘要肠缺血再灌注（I/R）损伤可引起局部和远处组织、器官损伤，严重者造成多器官功能障碍甚至衰竭，围术期死亡率极高，但目前针对肠I/R损伤的防治措施有限且效果欠佳。坏死性凋亡是一种与炎症反应紧密联系的新型程序性死亡方式。研究表明，肠上皮细胞的坏死性凋亡在肠I/R损伤的发生、发展中扮演重要角色。网络药理学是一种预测药物作用及作用机制的新兴技术。熊果酸（UA）是一种五环三萜类化合物，广泛存在于多种天然植物中。研究报道，UA具有肠道保护作用，并能减轻心、脑、肝、肾和视网膜的I/R损伤。但目前少有研究关注UA对肠I/R损伤的治疗作用，且具体作用机制尚未阐明。<br>　　目的：探讨UA对肠I/R损伤中坏死性凋亡的影响及调控机制，为UA防治肠I/R损伤提供理论依据。<br>　　方法：<br>　　1.UA对小鼠肠I/R损伤的影响<br>　　C57BL/6小鼠肠系膜上动脉缺血45min后再灌注2h，建立肠I/R损伤模型。将小鼠随机分为4组：假手术（Sham）组、Sham+UA组、I/R损伤（IRI）组和IRI+UA组。Sham+UA组和IRI+UA组小鼠造模前7d接受40mg/kg/d UA灌胃干预。取血清检测肠壁通透性标志物FD4、DAO、i-FABP、D?乳酸和炎症因子TNF-α、IL-1β、IL-6水平，取肠组织测定Chiu’s评分和紧密连接蛋白Occludin、Claudin-5、ZO-1水平。<br>　　2.UA对肠I/R损伤中RIP1/RIP3/MLKL通路介导的坏死性凋亡的影响<br>　　在体外实验中，IEC-6细胞氧糖剥夺（OGD）3h后复氧（R）4h，建立细胞OGD/R损伤模型。将细胞分为4组：正常（Control）组、Control+UA组、OGD/R组和OGD/R+UA组。Control+UA组和OGD/R+UA组细胞造模前4h接受15μM UA干预。检测细胞中ZO-1蛋白水平、炎症因子TNF、IL-1β、IL-6mRNA水平、坏死性凋亡相关蛋白RIP1、p-RIP3、p-MLKL、HMGB1、TLR4和NF-κB p65水平。<br>　　在体内实验中，建立肠I/R损伤小鼠模型，UA预处理小鼠，检测肠组织中坏死性凋亡细胞的数量、坏死性凋亡相关蛋白水平。<br>　　3.探索UA调控肠I/R损伤中坏死性凋亡的上游靶基因<br>　　搜集多个数据库获取UA治疗肠I/R损伤的靶基因，根据degree评分筛选核心靶基因。将排名靠前的关键核心靶基因编码的蛋白与UA进行分子对接。对核心靶基因进行GO和KEGG富集分析。检索与坏死性凋亡相关的关键核心靶基因。<br>　　在体外实验中，建立IEC-6细胞OGD/R损伤模型，UA预处理细胞，检测细胞中预测的关键核心靶基因mRNA水平、蛋白水平和蛋白磷酸化水平。在体内实验中，建立肠I/R损伤小鼠模型，UA预处理小鼠，检测肠组织中预测的关键核心靶基因蛋白水平和蛋白磷酸化水平。<br>　　4.验证UA通过STAT3调控坏死性凋亡减轻肠I/R损伤<br>　　根据第三章实验结果，推测UA调控肠I/R损伤中坏死性凋亡的上游靶基因是STAT3，本章进一步探索STAT3在UA调控坏死性凋亡中的作用。在体外实验中，建立IEC-6细胞OGD/R损伤模型，将细胞分为6组：Control组、OGD/R组、OGD/R+UA组、OGD/R+UA+Col（colivelin,STAT3激动剂）组、OGD/R+Sta（stattic,STAT3抑制剂）组和OGD/R+UA+Sta组，按分组处理细胞。检测细胞中ZO-1蛋白水平、炎症因子mRNA水平、STAT3蛋白磷酸化水平和坏死性凋亡相关蛋白水平。<br>　　在体内实验中，建立肠I/R损伤小鼠模型，将小鼠随机分为6组：Sham组、IRI组、IRI+UA组、IRI+UA+Col组、IRI+Sta组和IRI+UA+Sta组，按分组处理小鼠。检测肠组织病理学损伤程度、肠组织中坏死性凋亡细胞的数量、STAT3蛋白磷酸化水平和坏死性凋亡相关蛋白水平。<br>　　结果：<br>　　1.UA减轻小鼠肠I/R损伤<br>　　UA可改善肠I/R损伤小鼠肠组织病理学损伤程度，降低Chiu’s评分，减少血清中肠壁通透性标志物和炎症因子含量，升高肠组织中紧密连接蛋白水平。<br>　　2.UA抑制肠I/R损伤中RIP1/RIP3/MLKL通路介导的坏死性凋亡<br>　　体外实验发现，UA能升高OGD/R损伤细胞中ZO-1蛋白水平，降低炎症因子mRNA水平，减少坏死性凋亡相关蛋白表达。<br>　　体内实验发现，UA能减少肠I/R损伤小鼠肠组织中坏死性凋亡细胞的数量，降低坏死性凋亡相关蛋白表达水平。<br>　　3.UA可能通过STAT3抑制肠I/R损伤中的坏死性凋亡<br>　　经数据库检索，获取UA治疗肠I/R损伤的靶基因121个，从中筛选出核心靶基因49个，其中排名第一的是STAT3。将STAT3蛋白与UA进行分子对接，对接能为-7.6kcal/mol，表示二者有很强的结合能力。GO和KEGG富集分析结果显示，生物学通路主要包括凋亡、TNF和I-κB/NF-κB信号通路，提示坏死性凋亡的存在。KEGG PATHWAY数据库检索发现，STAT信号通路调控坏死性凋亡性凋亡关键分子RIP1。<br>　　体内、外实验发现，UA可降低肠I/R损伤小鼠肠组织和OGD/R损伤IEC-6细胞中STAT3蛋白的磷酸化水平，进一步验证了上述网络药理学的预测结果。<br>　　4.UA通过STAT3抑制RIP1/RIP3/MLKL通路介导的坏死性凋亡减轻肠I/R损伤<br>　　体外实验发现，UA和Sta分别干预的OGD/R损伤IEC-6细胞中，ZO-1蛋白水平升高，炎症因子mRNA水平降低，STAT3蛋白磷酸化水平降低，坏死性凋亡相关蛋白表达减少；Sta与UA共同干预比UA单独干预治疗效果更好；而Col干预逆转了UA对细胞OGD/R损伤的治疗作用。<br>　　体内实验发现，UA和Sta分别干预的肠I/R损伤小鼠肠组织病理学损伤程度减轻，Chiu’s评分降低，肠组织中坏死性凋亡的细胞减少，STAT3蛋白磷酸化水平降低，坏死性凋亡相关蛋白表达减少；Sta与UA共同干预比UA单独干预治疗效果更好；而Col干预逆转了UA对小鼠肠I/R损伤的治疗作用。<br>　　结论：UA通过抑制STAT3激活调节RIP1/RIP3/MLKL通路介导的坏死性凋亡，减轻肠I/R损伤。