检索历史 清除

摘要鉴于广泛的耐药性和副作用，肝癌患者治疗效果仍然不佳。因此，开发有效的治疗策略仍然是肝癌治疗领域的主要研究重点。“铜死亡”，一种新近发现的由铜离子在细胞内积聚引发的细胞死亡方式，为肿瘤治疗提供了潜在策略。然而，其确切的发生机制仍待进一步研究和阐明。人体肝脏中储存了约20%的铜元素，且研究揭示出肝癌组织内存在铜离子积累现象，使得肝癌细胞天然处于高铜环境。因此，积极探索铜死亡在肝癌治疗中的潜力，可能为肝癌治疗提供全新的策略。基于铜死亡具有代谢选择性，调节细胞的代谢模式，可能增强肝癌细胞对铜死亡的敏感性，从而最大化铜死亡机制在肝癌治疗中的效果。我们发现大黄素是一种效率显著的代谢调节剂，其在增强铜死亡作用中的应用价值值得进一步探讨。通过将大黄素的代谢调节作用与铜死亡机制相结合，可能能够开发出有效的肝癌治疗策略。<br>　　目的：（1）利用文献计量学和生物信息学探索铜死亡在肝癌治疗领域的潜力；（2）验证伊利司莫（Elesclomol,ES）能否诱导肝癌细胞发生铜死亡；（3）探索肝癌细胞中铜死亡的代谢选择性；（4）阐明大黄素诱导肝癌细胞发生代谢重编程的机制，并验证大黄素可通过该机制增强肝癌细胞对铜死亡的敏感性。<br>　　方法：（1）通过科学引文索引（Web of Science,WOS）数据库中的核心合集，基于主题搜索短语“TS=（Cuproptosis）”，下载截至2023年11月15日的所有铜死亡相关英文文献，并通过文献计量学分析软件，包括VOSviewer（version1.6.16）和R软件（version4.3.0）中的“bibliometrix”包，对所有铜死亡相关文献的国家、机构、作者、期刊、论文及其引文、作者关键词、扩大关键词，进行合作、共现、耦合和共引分析，探索铜死亡在癌症治疗领域的潜力;（2）从TCGA数据库和ICGC数据库下载肝癌的mRNA表达谱、体细胞突变信息和相匹配的临床数据，进行铜死亡相关基因的差异表达分析、基因突变分析、并进行风险模型构建以及一致性聚类，之后基于风险模型和聚类，进行生存分析、功能富集分析、免疫细胞浸润分析和免疫治疗反应预测，并重点探索了肝癌细胞代谢模式和铜死亡的关系；（3）利用MTT、细胞集落形成实验、AnnexinV-FITC/PI双染色法以及透射电镜探索ES对两种肝癌细胞系SMMC-7721和HepG2生物学行为的影响；（4）通过检测细胞铜离子浓度变化，并观察siRNA敲低铜死亡关键调节因子FDX1后的生物学行为改变明确ES是否能诱导肝癌细胞发生铜死亡；（5）通过胞外酸化率（Extracellular Acidification Rate，ECAR）和氧气消耗率（Oxygen Consumption Rate，OCR）明确HepG2细胞的代谢状态被2DG改变后，利用MTT实验、细胞划痕实验、AnnexinV-FITC/PI双染色法、细胞集落形成实验以及通过Western Blot检测铁硫簇蛋白和蛋白质毒性应激标志物HSP70探索细胞代谢状态改变对铜死亡的影响；（6）再次通过MTT、AnnexinV-FITC/PI双染色法、细胞划痕实验、Western Blot检测铁硫簇蛋白和蛋白质毒性应激标志物HSP70，探索大黄素是否具有增强肝癌细胞对铜死亡敏感性的功能，并通过Western Blot检测Cleaved Caspase-3蛋白以及荧光显微镜检测活性氧物质（Reactive Oxygen Species，ROS）排除其他可能的抑癌机制；（7）利用生物信息分析技术、网络药理学、转录组测序以及OCR和ECAR检测，探索大黄素对肝癌细胞代谢的影响，并基于分子对接技术预测大黄素影响糖酵解功能的分子靶点是PGAM1，通过检测大黄素处理以及在大黄素处理基础上过表达PGAM1的不同处理情况下，PGAM1的产物2-PG，OCR和ECAR水平的变化以及细胞热转移实验，明确大黄素影响糖酵解功能的具体机制是靶向PGAM1蛋白；（8）构建免疫缺陷BALB/c nu/nu裸鼠的HepG2异种移植瘤模型，观察ES、大黄素以及ES联合大黄素处理对移植瘤的影响，并使用免疫组化检测肿瘤中KI67和HSP70的表达，以验证大黄素在体内是否能增强ES对肝癌的抑制作用。<br>　　结果：（1）基于文献计量学分析的结果，铜死亡的研究焦点目前聚集在肿瘤治疗领域，大量研究揭示了铜死亡在肿瘤治疗领域的潜力。此外，高频关键词分析显示，代谢以及药物敏感性是当前铜死亡领域的焦点问题和未来可能的发展方向，这为我们的研究提供了指导；（2）铜死亡相关的风险模型和一致性聚类的功能富集分析结果显示，铜死亡与肝癌细胞代谢模式存在密切联系，这进一步强化了我们研究的基础；（3）ES在有铜离子的环境中，能够有效抑制SMMC-7721和HepG2细胞的活性、克隆形成能力、侵袭能力等肿瘤生物学特性，导致线粒体损伤，并显著诱导细胞死亡；（4）ES可诱导细胞中铜离子的累积。敲低铜死亡关键调节因子FDX1的表达量会减弱ES对细胞的肿瘤生物学特性的抑制作用，表明ES对肝癌细胞的抑制作用是通过铜死亡；（5）抑制HepG2细胞糖酵解功能增强了ES对细胞的肿瘤生物学特性的抑制作用，并加剧了ES诱导的铁硫簇蛋白和HSP70的失调，表明铜死亡具有代谢选择性；（6）大黄素可有效增强ES对细胞的肿瘤生物学特性的抑制作用，加剧ES诱导的铁硫簇蛋白和HSP70的失调，并且不会导致Cleaved Caspase-3蛋白和ROS的升高，表明大黄素通过增强细胞对铜死亡的敏感性发挥协同抗癌作用，而非其他抑癌机制；（7）生物信息学结果显示肝癌组织的糖酵解功能较正常肝组织明显升高，网络药理学、转录组测序以及OCR和ECAR检测表明大黄素可有效减弱SMMC-7721和HepG2的糖酵解功能。分子对接结果显示大黄素可与PGAM1蛋白有效结合。过表达PGAM1可逆转大黄素对HepG2细胞中，PGAM1的产物2-PG、OCR和ECAR水平的影响。细胞热转移实验表明大黄素可与PGAM1蛋白有效结合。这表明大黄素可通过与PGAM1蛋白结合，影响其作为糖酵解关键酶的活性，抑制细胞糖酵解水平，从而增强细胞对铜死亡的敏感性；（8）BALB/c nu/nu裸鼠的HepG2异种移植瘤模型中，大黄素与ES联合使用可协同抑制肿瘤生长。免疫组化结果显示，大黄素增强了ES对KI67表达的抑制作用，同时增强了ES对蛋白质毒性应激标志物HSP70表达的诱导。这表明大黄素在体内能增强ES对肝癌的抑制作用。<br>　　结论：（1）文献计量学和生物信息学分析表明铜死亡在肝癌治疗领域展现出显著潜力；（2）ES能够通过诱导肝癌细胞发生铜死亡，抑制其肿瘤生物学特性；（3）抑制糖酵解功能可显著增强肝癌细胞对铜死亡的敏感性；（4）大黄素与ES具有协同抗肝癌作用。机制为大黄素可通过靶向PGAM1蛋白，影响其作为糖酵解关键酶的活性，抑制细胞糖酵解水平，从而增强细胞对铜死亡的敏感性。