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摘要背景及目的：<br>　　骨缺损是临床上常见的骨科疾病，常常会影响患者的生活质量和心理健康。目前治疗骨缺损主要以手术治疗为主，手术存在诸多的风险及并发症。随着“组织工程”的出现，骨组织工程技术为修复骨缺损提供了新的思路，但是传统方法制备的骨组织工程支架虽具有一定的力学性能和生物相容性，却无法模拟骨组织的结构和功能，使其不能与骨缺损区域相匹配，限制了其在临床的应用。3D 打印作为一种新起的支架制造技术，被广泛应用于骨组织工程，而生物活性物质（多肽等）中包含多种生长因子，能够激活机体骨修复机制促进骨组织再生。因此，构建负载生物活性物质的仿生骨组织工程支架已成为骨缺损修复研究的热点话题。本研究针对传统骨组织工程支架的缺点和不足，通过3D生物打印的方式制备一种出符合骨组织结构和力学性能的珍珠层粉（NP）/海藻酸钠（SA）复合支架，以满足骨组织的生理需求。随后将生物活性物质——富血小板纤维蛋白（PRF）负载于该支架上，充分发挥其和NP/SA支架的协同作用，加速骨组织再生，为临床治疗骨缺损提供了一种新的策略。<br>　　方法：<br>　　（1）NP/SA支架的制备及表征：制备出不同比例（0∶1、1∶2、1∶1、2∶1）NP/SA生物墨水，通过检测其粘度和流变性能，评估生物墨水的可打印性。优化3D打印的条件，通过CaCl2交联和冷冻干燥技术制备出不同比例（0∶1、1∶2、1∶1、2∶1）的 NP/SA 支架。运用扫描电子显微镜（SEM）、傅立叶变换红外光谱（FT-IR）和 X-射线衍射（XRD）等方法对支架进行理化表征和形貌观察；采用称重法测试支架的溶胀特性和降解性能；运用万能材料试验机测试支架的力学性能，从而筛选出最佳比例的NP/SA支架。<br>　　（2）PRF 的制备及检测：采用血液离心法制备 PRF，运用 Hamp;E 染色和免疫组织化学分析方法观察PRF的组织结构并检测其促进骨再生的生物组分。<br>　　（3）PRF/NP/SA支架细胞生物相容性评估和成骨能力的研究：将制备的PRF膜负载于NP/SA（1∶1）支架上形成PRF/NP/SA复合支架，通过细胞黏附实验、MTT法、Calcein-AM/PI活-死细胞荧光双染法、碱性磷酸酶测试（ALP）及茜素红染色（ARS）来评估支架的生物相容性和体外成骨分化能力。<br>　　（4）PRF/NP/SA支架原位骨再生效果评价：建立新西兰兔临界颅骨缺损模型，将Control组、SA组、NP/SA组和PRF/NP/SA组支架分别植入新西兰兔颅骨缺损处，在 4 周和 8 周时将新西兰兔麻醉处死后，获取颅骨大体标本，通过Micro-CT 检测四组支架促进骨再生的效果，并通过组织学研究进一步分析评估骨再生的效果及机制。<br>　　结果：<br>　　（1）采用3D生物打印技术成功制备个性化的NP/SA水凝胶支架，实验结果表明不同比例（0∶1、1∶2、1∶1、1∶2）的NP/SA生物墨水均能表现出良好的流变性能，其中 NP/SA（1∶1）生物墨水最能维持支架的形状。四组支架的孔隙率均大于50%；SEM表明NP/SA（1∶1）支架组的表面分布着致密有序的孔隙结构，孔径大约在 400-700 μm，符合骨组织的结构特性；NP/SA（1∶1）支架组降解率较低，可与骨再生的速率相匹配；NP/SA（1∶1）支架组弹性模量为 22.92±0.84 MPa；可达到松质骨的力学要求。为此，本研究选择综合性能较佳的 NP/SA（1∶1）支架进行后续一系列实验。<br>　　（2）采用离心法成功制备PRF，运用Hamp;E染色观察塑形后PRF膜，其微观结构为疏松的网状纤维蛋白，多呈粉红色，在其上方可见大量白细胞和血小板聚集，免疫组织化学分析表明PRF中相关血管生长因子（PDGF、VEGF和TGF-β）的表达呈强阳性，说明PRF可促进血管再生，从而有利于成骨。<br>　　（3）与其它三组支架相比，PRF/NP/SA支架组有更加良好的生物相容性和体外成骨活性：PRF/NP/SA 支架组细胞增殖分化更加成熟；各组支架的细胞存活率在80%以上；在第 21 d 时，PRF/NP/SA 组中 ALP 的表达量最高且有大量橘红的钙结节形成；说明PRF的加入可增强NP/SA支架上干细胞的增殖分化和诱导成骨的能力。<br>　　（4）将各组支架植入新西兰兔临界颅骨缺损模型中，通过大体标本观察和Micro-CT检查，发现PRF/NP/SA支架组在体内成骨效果最好；进一步对兔颅骨大体标本进行 Hamp;E 染色、Masson 染色和免疫组织化学分析，发现 PRF/NP/SA组中具有类似于松质骨的结构，同时该支架组中相关成骨因子（ RUNX-2 和COL-Ⅰ）和血管生长因子(VEGF)的表达量比其它三组高，说明了 PRF/NP/SA 支架组中NP和PRF发挥协同作用，促进骨组织再生。<br>　　结论：<br>　　基于天然骨组织的结构特性，运用3D生物打印技术制备出一种模拟天然骨松质结构的仿生骨组织工程支架（NP/SA），随后将PRF负载于NP/SA支架上，充分发挥NP和PRF的协同作用调节成骨微环境，有效促进骨组织再生，从而证明了 PRF/NP/SA 支架具有良好的成骨潜力，可为临床修复骨缺损提供一种有前景的治疗策略。