检索历史 清除

摘要暴露在以低压低氧（Hypobaric Hypoxia, HH）为主要特征的高海拔地区会造成不同程度的器官损伤。氧分压降低减少了供应给大脑的 O2，而哺乳动物大脑对氧气产生 ATP的依赖使其极易受到 HH诱导的损伤，轻者出现头晕、头痛、耳鸣、恶心、呕吐等症状，重者诱发高原脑水肿。因此，如何治疗和改善HH诱导的脑损伤被研究人员广泛关注。硝基氮氧自由基（HPN）作为一类新型高效的抗氧化剂，对HH诱导的脑组织损伤具有保护作用，然而，由于其稳定性差、代谢时间短，缺乏靶向性，这在很大程度上限制了HPN的应用。纳米药物递送系统（Nanoparticles drug delivery system, NDDSs）作为一种新型的药物递送系统（Drug delivery system, DDS），具有颗粒小、比表面积大、吸附能力强等特性，将药物包载于纳米粒中，可以提高药物在体内的稳定性、延长药物作用时间。此外，HH导致的机体学习记忆能力下降与大脑神经元线粒体损伤有关，同时伴随线粒体氧化磷酸化和三羧酸循环功能的异常以及机体自由基的释放增加。将HPN富集于线粒体中，直接清除过量的ROS，保护或维持缺氧过程中线粒体功能，能够进一步增强其对低压低氧脑损伤的预防或治疗作用。因此，我们设计了一种装载线粒体HPN的PLGA纳米粒，探讨该纳米制剂对低压低氧诱导脑损伤的保护作用。<br>　　目的：<br>　　以三苯基磷为线粒体靶向分子，以聚（乳酸-羟基乙酸）（PLGA）为聚合物载体，构建一种负载线粒体靶向HPN（TPP-HPN）的纳米粒（TPP-HPN@PLGA），以增加HPN的靶向性和稳定性，提高对低压低氧诱导脑组织损伤的保护作用。<br>　　方法：<br>　　（1）以HPN和TPP为原料，以烷基链为桥联基，合成TPP-HPN化合物；建立TPP-HPN的高效液相色谱分析方法，用于检测纳米颗粒的包封率和载药量。<br>　　（2）使用乳化溶剂挥发法制备负载 TPP-HPN的 PLGA纳米粒。通过单因素控制变量法考察制备工艺的影响因素，进而通过Box-Behnken法（BBD）对制备工艺进行优化。<br>　　（3）通过扫描电镜、透射电镜、动态光散射对纳米粒的形貌表征、粒径分布和ζ电位进行检测；采用动态透析法对其体外释放性能进行表征，并考察其稳定性；通过溶血实验、细胞摄取实验对其生物相容性进行考察；通过体内分布实验考察纳米粒在体内的分布规律。<br>　　（4）采用常压密闭缺氧实验验证其抗缺氧活性；利用低压低氧诱导脑组织损伤小鼠模型评价 TPP-HPN@PLGA NPs的保护作用。<br>　　结果：<br>　　（1）通过两步反应，以52%产率合成得到TPP-HPN，产物结果经高分辨质谱和红外光谱表征与目标化合物结构一致；成功建立TPP-HPN高效液相色谱含量测定的方法，在3.125~100μg/mL内线性关系良好，R2=0.9999，精密度和溶液稳定性的RSD均小于2%。<br>　　（2）在筛选纳米粒制备工艺实验中，单因素实验筛选了乳化剂种类、药载比、乳化剂比例、油水比、超声功率和超声时间等影响因素，实验结果表明，PLGA用量、油水比和稳定剂用量对纳米粒各项指标影响较大；通过BBD法对制备工艺进行优化设计，并结合 Design-Expert软件的多元回归方程拟合、方差分析、显著性检验和响应面分析，可以有效地筛选最优的纳米颗粒制备工艺；最佳制备工艺为波洛沙姆188浓度0.3%，胆酸钠浓度0.1%，药载比（TPP-HPN∶PLGA）1∶10，油水相体积比1∶10，超声功率200 W超声5 min。<br>　　（3）SEM和TEM显示纳米粒子保持分散而不聚集；平均粒径为（120.76±3.82） nm，PDI为（0.302±0.021），ζ电位值为（-27.93±0.59）mV，包封率为（89.32±0.33）%，载药量为（6.82±0.26）%；稳定性评价显示纳米粒在4℃条件下保存14天体系稳定，粒径和PDI未发生明显变化；体外释放实验结果表明，与原料药相比TPP-HPN@PLGA纳米粒在0~96 h内缓慢释放；溶血实验和安全性评价结果表明，纳米颗粒具有良好的生物相容性。<br>　　（4）常压密闭结果表明，TPP-HPN@PLGA NPs可显著延长小鼠常压密闭条件下的存活时间，具有良好的抗缺氧活性；组织病理学结果显示，经过TPP-HPN和TPP-HPN@PLGA NPs干预后，HH小鼠脑组织细胞损伤明显减轻，细胞形态趋于正常，神经细胞排列趋向规则，细胞间隙变小；与正常对照组相比，HH小鼠脑组织中氧化应激损伤加重，MDA和H2O2含量显著增加，抗氧化酶活力（T-SOD）和非酶抗氧化剂（GSH）含量显著降低，ATP含量及 ATP酶活力显著降低，脑组织与血清中促炎因子TNF-α和IL-6水平升高，抗炎因子IL-10水平降低。给予 TPP-HPN@PLGA NPs干预后因 HH诱导的脑损伤得到改善。Western blot结果表明，与正常对照组相比，HH组小鼠脑组织中缺氧相关蛋白HIF-1α和VEGF表达水平显著上调，抗氧化应激相关蛋白Nrf2和HO-1的表达上调，炎症相关蛋白NF-κB与TNF-α的表达显著上调，凋亡相关蛋白Bcl-2显著下调，Bax与Cleaved Caspase-3表达显著上调，Bax/Bcl-2比值显著性上调。在给予纳米粒干预后，情况发生了逆转。抗氧化应激相关蛋白 Nrf2和 HO-1的表达进一步上调，其他相关蛋白的表达均显著下调，这表明纳米制剂有效地缓解了低压低氧引起的脑组织损伤。<br>　　结论：<br>　　本课题成功构建了负载线粒体靶向 HPN（ TPP-HPN）的纳米粒（ TPP-HPN@PLGA NPs），平均粒径为（120.76±3.82）nm，呈球形，分散性良好，粒径均匀，且具有良好的稳定性、体外释药性能和生物相容性；该纳米粒对低压低氧诱导的脑组织损伤具有显著的保护作用。