检索历史 清除

摘要通过对本实验室斑马鱼全基因组进行关联分析（GWAS），定位到与鳍条表型存在关联的基因kcnj15，经查找资料发现，Kcnj15又称为IRKK、KIR1.3和KIR4.2，是KIR4.x亚家族的成员，编码一个钾离子（K）通道蛋白，在多个器官如肾脏、肺和胰腺中表达，在肾脏、胃与神经系统中发挥着极其重要的功能，被认为在维持钾离子和酸碱的平衡中发挥重要功能。为进一步揭示kcnj15在鱼类中的功能，本研究通过CRISPR/Cas9基因编辑技术，在斑马鱼中构建了一种kcnj15-/-斑马鱼纯合突变体，观察发现，kcnj15-/-斑马鱼纯合突变体成鱼可较长时间待在鱼缸中下层，而野生型的分布则较为均匀。我们提出猜想，kcnj15的敲除是否改变了斑马鱼的低氧耐受性，使得斑马鱼可以长期适应底部的环境？为了验证本研究的猜想，我们对kcnj15-/-斑马鱼纯合突变体胚胎与野生型斑马鱼胚胎进行转录组测序，筛选到与血红蛋白相关的差异表达基因，其中血红素合成限速酶基因hmox2a、血红蛋白合成相关基因hbbe1.2、hbbe2和hbbe5均存在表达差异；为了进一步探究kcnj15与血红蛋白之间的关联，采用O-dianisidine血红蛋白染色、血红蛋白ELISA检测以及qPCR技术对kcnj15-/-斑马鱼胚胎、成鱼的血红蛋白水平和血红蛋白相关基因表达状况进行了检测。考虑到血红蛋白水平与机体耐低氧能力高度相关，进一步通过缺氧胁迫检测了kcnj15-/-斑马鱼纯合突变体胚胎和野生型斑马鱼胚胎的低氧耐受能力，并检测了HIF相关基因的表达水平变化，为kcnj15的功能研究提供新思路。其具体研究结果如下：<br>　　1.在斑马鱼中构建了kcnj15-/-纯合突变体<br>　　本研究在斑马鱼中通过qPCR技术验证了kcnj15在斑马鱼胚胎各个时期的表达情况和斑马鱼成鱼中各个器官中的表达模式，发现kcnj15在斑马鱼胚胎的表达水平总体上随着发育时间增加而增长，证明kcnj15在参与了胚胎的发育过程。在斑马鱼成鱼中，表达水平最高的器官是心脏，在肾脏、肌肉和肝脏中的表达水平其次。这表明kcnj15在心血管方面可能具有着重要的功能。为了探究kcnj15的功能机制，本实验进一步通过CRISPR/Cas9基因编辑技术，在斑马鱼构建了一种kcnj15-/-纯合突变体。<br>　　2.kcnj15-/-斑马鱼纯合突变体胚胎转录组分析<br>　　本研究将发育到120hpf的kcnj15-/-斑马鱼突变体胚胎和野生型斑马鱼胚胎进行转录组测序，共计获得cleanreads255,206,080条，原始数据过滤后的碱基数（cleanbases）38.28G。kcnj15-/-斑马鱼纯合突变体胚胎各组间的相关性系数差异明显小于野生型斑马鱼胎。共计获得显著差异表达基因1911个，其中上调表达1053个，下调表达858个。通过差异基因GO通路富集分析发现，差异基因分布最为显著的GO功能富集项为细胞组分（CC）中的细胞外空间（extracellularspace）；MF中的血红素结合能力（hemebinding）、四吡咯环结合能力（tetrapyrrolebinding）和氧化还原酶活性，作用于成对供体，包含或还原分子氧（oxidoreductaseactivity,actingonpaireddonors,withincorporationorreductionofmolecularoxygen）以及BP中的调节蛋白酶活性（regulationofpeptidaseactivity）、调节内肽酶活性（regulationofendopeptidaseactivity）和炎症反应（inflammatoryresponse），其中血红素结合能力、四吡咯环结合能力以及氧化还原酶活性都与血红蛋白高度相关。在差异表达基因中，筛选到与炎症反应高度相关的il1b、ptsg2a、ptsg2b、tnfrsf1a和duox等基因；与蛋白酶活性高度相关的a2ml1、serpinf2b、birc2、serpine1、col7a1和spink4等基因；与血红蛋白高度相关的hmox2a、hbbe1.2、hbbe2和hbbe5等基因。<br>　　3.kcnj15影响斑马鱼的血红蛋白水平和低氧耐受能力<br>　　通过对O-dianisidine血红蛋白染色和血红蛋白水平检测，证明了在kcnj15-/-斑马鱼纯合突变体胚胎与成鱼中血红蛋白水平均显著高于野生型斑马鱼。随后通过qPCR检测了血红蛋白相关基因的表达情况，发现编码血红蛋白的基因habe1、hbbe1.1、hbbe2、生成血红素限速酶的基因alas2以及调控红细胞生成的基因gata1都显著上调，而与血管发育相关的基因fli1a显著下调，证明kcnj15的敲除显著增加了斑马鱼的血红蛋白水平，并改变了血红蛋白相关基因的表达水平。进一步将kcnj15-/-斑马鱼纯合突变体胚胎与野生型斑马鱼胚胎暴露于氧浓度为2%的低氧环境中，发现kcnj15-/-斑马鱼纯合突变体胚胎的低氧耐受能力显著高于野生型斑马鱼胚胎。通过qPCR检测缺氧诱导因子（hypoxia-induciblefactor，HIF）相关基因表达水平，发现缺氧相关基因的表达水平普遍上调。<br>　　综上所述，本研究通过CRISPR/Cas9基因编辑技术、转录组学和分子生物学等研究方法，在斑马鱼中构建了kcnj15-/-突变体，进一步实验发现kcnj15的敲除影响了斑马鱼胚胎的炎症反应、蛋白酶活性、血红素结合能力和氧化还原酶活性相关的基因表达水平，并首次揭示kcnj15的敲除可以显著增强斑马鱼的血红蛋白水平和低氧耐受性，为kcnj15的功能研究提供了新的研究方向。