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摘要目的化疗药物或放射线通过损伤肿瘤细胞的DNA来达到治疗目的，但研究表明癌细胞可通过识别损伤的DNA，进而激活相关修复机制，最终导致了癌细胞对化学药物及放射线的耐受作用。本研究旨在探索跨损伤DNA聚合酶ζ影响肺癌放化疗的作用机制及是否可通过调控跨损伤DNA聚合酶ζ的表达改变肺癌放化疗的增敏性，为提高肺癌的治疗疗效提供新的思路或靶点。<br>　　方法（1）采用实时荧光定量PCR和蛋白免疫组化，分别检测肺癌组织及癌旁组织中REV3L、REV7mRNA和蛋白的表达水平，并分析REV3L、REV7表达水平与患者临床病理参数之间的关系。（2）采用顺铂处理A549细胞和铂耐药的A549细胞，RT-qPCR及蛋白免疫印迹（WB）比较两组细胞中REV3L、REV7mRNA和蛋白水平表达；在铂耐药的A549细胞中，沉默REV3L或REV7，同时沉默REV3L和REV7，或过表达REV3L，顺铂处理后，MTT比较各组细胞增殖，流式细胞术比较各组细胞凋亡情况；在A549细胞中过表达REV3L，比较过表达前后细胞中NF-κB及ATM/ATR信号通路的表达情况；在A549细胞和铂耐药的A549细胞中，同时过表达REV3L及NF-κBp65后，顺铂处理后，MTT比较各组细胞增殖，流式细胞术比较细胞凋亡情况。（3）A549细胞进行0、2或6GyMVX射线处理，检测各组中REV3L和REV7的mRNA及蛋白表达水平；构建Mut-REV3L转染稳定细胞株，在REV3L野生型及突变型的A549细胞中，0、2、4及6GyX射线处理细胞24h后，显微镜下观察细胞形态的变化，MTT法比较各组细胞增殖能力的变化，流式细胞术比较各组细胞周期及凋亡的变化。（4）在A549细胞中过表达或干扰DNA聚合酶ζ，流式细胞术分析DNA聚合酶ζ过表达或低表达对肺癌细胞周期、凋亡的影响；对DNA聚合酶ζ过表达或低表达的A549细胞，进行0、2或6GyMVX射线处理，MTT法比较各组细胞增殖能力的变化，流式细胞术分析各组细胞凋亡的变化情况，通过对γH2AX进行免疫荧光染色，检测各组细胞中DNA损伤情况，WB比较各组细胞中凋亡相关蛋白的表达情况。（5）构建含有不同长度的DNA聚合酶ζ催化亚基REV3L基因启动子的荧光素酶报告基因载体：pGL3-2631、pGL3-1794、pGL3-841及pGL3-367。荧光素酶报告实验检测预测的转录因子对报告基因的激活作用；RT-PCR法比较NF-κB、Sp1过表达或低表达对REV3L及REV7表达的影响，并比较放射线照射前后细胞中NF-κB和Sp1的表达情况。（6）构建裸鼠移植瘤模型，观察治疗后肿瘤体积变化情况；WB检测DNA聚合酶ζ对荷瘤组织中凋亡相关蛋白表达的影响；免疫组化检测DNA聚合酶ζ对荷瘤组织中CD31表达的影响；免疫荧光检测DNA聚合酶ζ对荷瘤组织中γH2AX表达的影响。<br>　　结果（1）与癌旁组织相比较，REV3L和REV7在肺癌组织中mRNA及蛋白水平的表达均明显上升。REV3L和REV7在癌症组织中的表达与患者淋巴结转移和AJCC分期有关，而与年龄、组织类型无关。（2）与A549细胞组相比，铂耐药A549细胞中REV3L、REV7的mRNA表达水平及蛋白表达量均明显增加；与A549细胞相比，铂耐药A549细胞的增殖明显增加、凋亡明显减少，而在沉默REV3L或REV7，以及同时沉默REV3L和REV7后，铂耐药A549细胞的增殖显著降低，凋亡显著升高；在A549细胞及铂耐药A549细胞中过表达REV3L，均能够促进其对顺铂的耐药，提高细胞存活率，抑制细胞凋亡；过表达REV3L能够抑制ATM和ATR的磷酸化；A549细胞中过表达REV3L能够抑制顺铂的抗肿瘤作用，而同时抑制NF-κBp65表达部分逆转了REV3L对A549细胞及铂耐药A549细胞的活力及凋亡的影响。（3）6Gy照射后，肺癌A549细胞中REV3L及REV7的表达显著上升；2Gy照射后，A549细胞在显微镜下可观察到细胞稍有皱缩，数量小幅减少；4Gy照射后，细胞外围形态变的不规则，少数细胞出现开始脱落现象，细胞数显著减少；6Gy照射后，大量细胞出现脱落；REV3L野生型和突变型的A549细胞在2、4、6Gy照射后，细胞数量均显著减少，而REV3L突变组的细胞数均显著大于REV3L野生型组；REV3L野生型和突变型的A549细胞在放疗后，细胞周期变化差异显著，REV3L突变组的凋亡率显著高于REV3L野生型组；（4）在A549细胞中上调或下调DNA聚合酶ζ表达后，细胞周期及凋亡并无显著变化；在A549细胞中下调DNA聚合酶ζ表达，联合放射治疗后，细胞增殖显著降低，凋亡率显著上升；而在细胞中上调DNA聚合酶ζ后，细胞增殖显著增加，而凋亡率显著下降；相对于低表达DNA聚合酶ζ的细胞株，在DNA聚合酶ζ过表达细胞株中，G1期细胞显著减少；相对于对照组，DNA聚合酶ζ过表达的A549细胞中，γH2AX表达明显减少，而在DNA聚合酶ζ低表达的A549细胞中，γH2AX表达显著增多。与对照组相比，DNA聚合酶ζ过表达后，细胞中caspase-3及caspase-7蛋白水平显著降低，Bax水平降低，Bcl-2水平增加；在DNA聚合酶ζ低表达后，细胞中caspase-3及caspase-7水平均显著增加，Bax水平显著升高，Bcl-2的水平显著下降。DNA聚合酶ζ过表达细胞中，细胞色素C表达显著上升，而DNA聚合酶ζ低表达细胞中，细胞色素C表达显著降低。（5）荧光素酶报告基因结果提示，放射线调控REV3L、REV7的启动子响应区域最主要分别为pGL3-2631、pGL3-2841；NF-κB、Sp1调控REV3L启动子的最主要作用位点为pGL3-2631；NF-κB、Sp1调控REV7启动子的最主要作用位点为pGL3-2841；NF-κB及Sp1共转染REV3L基因启动子pGL-2631后，Sp1和NF-κB的转录活性均有显著性增高；NF-κB和Sp1过表达能够显著提升A549细胞中REV3L和REV7mRNA的表达，NF-κB和SP1低表达能够显著抑制REV3L和REV7mRNA的表达；4、6Gy的放射线处理能够显著升高A549细胞胞浆和胞质中NF-κBp65和Sp1的mRNA及蛋白表达水平，2Gy剂量的放射处理能够增加A549细胞胞浆和胞质中NF-κBp65的表达，不影响Sp1的表达。（6）在裸鼠荷瘤模型中，X射线照射后，DNA聚合酶ζ低表达组的肿瘤体积缩小；DNA聚合酶ζ低表达后，caspase-3及caspase-7蛋白量增加，Bcl-2下降，Bax增多。在线粒体内，细胞色素C表达减少，细胞胞浆中细胞色素C则显著上升；DNA聚合酶ζ低表达减少异种移植模型裸鼠肿瘤组织中CD31的表达；而γH2AX表达明显增加。<br>　　结论REV3L和REV7在肺癌组织中的表达水平显著高于癌旁组织，且在铂耐药A549细胞中REV3L及REV7的mRNA表达水平也显著升高。抑制REV3L及REV7后，铂耐药A549细胞的增殖显著降低，凋亡显著升高；而过表达REV3L后，铂耐药A549细胞的存活率升高，细胞凋亡降低，表明抑制DNA聚合酶ζ的表达可增强A549细胞的化疗敏感性，而这种作用是通过调控ATM/ATR活化实现。放疗能够增加肺癌细胞中NF-κB和Sp1的表达，NF-κB、Sp1可结合REV3L、REV7上游启动子，调控REV3L、REV7的转录，启动DNA损伤修复机制，产生放疗抵抗；抑制DNA聚合酶ζ后A549细胞的放疗敏感性显著增强。综上所述，本研究进一步证实了DNA聚合酶ζ对放化疗的抗拒作用，明确了DNA聚合酶ζ引起放化疗抵抗的相关分子机制，并通过细胞水平及动物水平证实了抑制DNA聚合酶ζ的表达可提高肿瘤细胞对放化疗的敏感性，为寻找以DNA聚合酶ζ为靶点的放化疗增敏方法提供了相关的理论基础。