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摘要研究背景：<br>　　肺癌是我国 30 年来发生率增长最快的恶性肿瘤，其中，肺腺癌在肺原发肿瘤中占比最高，约为 40%-55%。锌指蛋白 687 (ZNF687)是一种 C2H2 锌指蛋白，在骨巨细胞瘤和急性髓系白血病(AML)中发生突变并上调，提示ZNF687在癌症中具有致癌作用。有报道ZNF687可能是肺腺癌潜在生物标志物，而对于其在肺腺癌中的表达水平、细胞学功能及分子生物学机制的研究，目前尚未见有相关报道。<br>　　研究目的：<br>　　鉴定ZNF687在肺腺癌组织和细胞中的表达水平，为进一步探讨其生物学功能奠定基础。探讨ZNF687对肺腺癌癌细胞生长、迁移、侵袭与转移恶性生物学行为影响并探讨有关信号通路机制。通过本研究，旨为阐明肺腺癌的病因，发生发展以及转移、复发的分子机理提供一个新的思路，为探寻肺癌治疗的有效靶点预测指标开拓新思路和提供理论依据。<br>　　研究方法：<br>　　生物信息学分析鉴定 ZNF687 在肺腺癌的表达情况，western blotting 检测新鲜的肺腺癌手术癌组织及癌旁组织，正常肺上皮细胞系与肺腺癌细胞系中 ZNF687 的蛋白表达情况。收集 20 例肺腺癌癌组织及癌旁组织手术标本蜡块并购买附带完整的患者临床资料及生存时间记录的肺腺癌组织芯片进行免疫组化及生存分析统计。<br>　　通过构建ZNF687过表达和干扰载体慢病毒包装，通过转染并筛选稳定表达细胞株，采再用细胞培养、基因转染、CCK8实验、平板克隆实验、划痕实验、流式细胞测周期及 Transwell迁移侵袭实验来验证ZNF687生物功能，并且通过 qRT-PCR 和 western blotting 法检测相关基因及蛋白表达情况，并进行回复实验验证。<br>　　为了进一步探索 ZNF687 在肺腺癌增殖、侵袭与转移的作用，通过生物信息学分析提示ZNF687 可能起转录因子作用，进一步筛选出靶基因，并通过qRT-PCR 和 western blotting 间接验证是否存在相关性。通过双荧光素酶报告基因检测进行直接验证。针对靶基因进行过表达和干扰载体并包装慢病毒，通过转染并筛选稳定表达细胞株，再用ZNF687与靶基因共转染，通过细胞培养、基因转染、CCK8实验、平板克隆实验、划痕实验、流式细胞测周期及 Transwell迁移侵袭实验来验证ZNF687 调控靶基因生物功能，寻找相关通路，并通过 qRT-PCR 和 western blotting法检测相关基因及蛋白表达情况，并进行回复实验验证。动物实验评估成瘤情况，瘤体取出后行免疫组化。<br>　　实验结果：<br>　　生物信息学分析提ZNF687 包括肺腺癌中的绝大部分肿瘤中高表达。Western blotting 结果提示癌旁肺组织低表达，肺腺癌组织高表达。免疫组化提示 ZNF687高表达与病理分级(P =0.0293)、阳性淋巴结个数（ P =0.0445）、淋巴转移分期(P =0.0325)、临床TNM分期(P =0.0253)等临床特征呈正相关，表明 ZNF687 过表达是肺腺癌预后不良的危险因素。ZNF687低表达组肺腺癌患者的OS显著延长。<br>　　CCK-8、平板克隆实验表明，过表达ZNF687促进A549和H1299细胞的增殖。流式细胞检测细胞细胞周期检测过表达ZNF687可降低肺腺癌细胞G0/G1期比例，促进细胞进入S期。划痕实验、Transwell迁移侵袭实验提示ZNF687过表达促进肺腺癌细胞迁移、侵袭。qRT-PCR和western blotting 实验表明，ZNF687 过表达使CDK2、CDK4、CDK6、Cyclin D1、Cyclin D3 mRNA 和蛋白水平升高，p53、p21、p27水平降低，从而促进了G1/S期的发展。p21在A549和H1299细胞中可能上调或下调，表明p21在ZNF687调控中具有p53独立的功能。过表达ZNF687增加了间充质生物标志物N-cadherin、Vimentin、Snail、Slug， MMP2和 MMP9 的表达，减少了上皮生物标志物 E-cadherin 的丰度。过表达 ZNF687 可以增加 PI3K/AKT 信号通路相关蛋白 AKT、p-AKTThr308、p-AKTSer473、p-PDK1Ser241、p-c-RafSer259、p-GSK-3βSer9和p-PTENSer380的表达。回复实验表明PI3K抑制剂LY294002显著抑制过表达ZNF687促癌作用。干扰ZNF687可抑制生长、侵袭、转移。实验证明ZNF687可通过PI3K/AKT信号通路调控肺腺癌增殖、侵袭和转移。<br>　　生信分析提示ZNF687 可能是CKS2上游转录因子。Western blotting 检测肺癌组织及癌旁肺组织中CKS2的表达，与ZNF687表达趋势一致，CKS2在肺腺癌组中及细胞中高表达，起癌基因作用。免疫组化结果显示，CKS2 在肺腺癌癌组织中主要呈高表达，主要定位于癌细胞核及细胞浆，ZNF687与CKS2在肺腺癌中具有正相关性。双荧光素酶报告基因检测结果提示，ZNF687可作为转录因子结合CKS2启动子区域，ZNF687可作为转录因子结合CKS2启动子区域，证明CKS2是ZNF687的靶基因。<br>　　c-Met在PI3K/AKT上游，常常调控PI3K/AKT信号通路，我们猜想，ZNF687可能进一步调控 c-MET来调控其下游靶向分子。在我们的实验中，western blotting 分析结果显示过表达ZNF687可上调c-Met表达水平,干扰ZNF687可下调c-Met的表达。ZNF687可能作为转录因子靶向癌基因CKS2启动子区调控c-Met，结合生物功能实验，过表达CKS2可以增强肺腺癌细胞的增殖、侵袭与转移，我们继续研究 CKS2 能否靶向 c-Met及 PI3K/AKT 信号通路。Western blotting 分析结果显示，在A549、H1299细胞中，干扰CKS2可下调c-Met、AKT、CDK2的表达，上调p21表达；过表达CKS2可上调c-Met、AKT、CDK2表达水平,下调p21表达；通过回复实验，在过表达CKS2细胞中转染干扰ZNF687，减弱了c-Met、AKT、CDK2表达,增强了p21的表达。<br>　　动物皮下成瘤体提示相对对照组（Vector）），ZNF687过表达（Lv-ZNF687）成瘤体积更大，相对对照组（sh-NC），ZNF687干扰组（sh-ZNF687）成瘤体积明显减小。动物瘤组织免疫组化提示ZNF687与CKS2、AKT、Ki-67呈正相关。<br>　　结论：<br>　　（1）ZNF687在肺腺癌组织及细胞中高表达，起癌基因作用。ZNF687高表达与病理分级(P =0.0293)、阳性淋巴结个数（P =0.0445）、淋巴转移分期(P =0.0325)、临床TNM 分期(P =0.0253)等临床特征呈正相关，是肺腺癌患者预后不良的危险因素。<br>　　（2）ZNF687过表达可通过调控PI3K/AKT/p21表达促进肺腺癌G1/S期细胞周期转变和细胞生长。p21在ZNF687调控中具有不依赖p53的作用。<br>　　（3）ZNF687过表达可能可以通过激活PI3K/AKT/Snail通路增强肺腺癌的迁移、侵袭能力，促进EMT的发生。干扰ZNF687可以通过抑制PI3K/AKT信号通路降低肺腺癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力。<br>　　（4）CKS2在肺腺癌组织及细胞中高表达，起癌基因作用。CKS2过表达可促进肺腺癌G1/S期细胞周期转变和细胞生长。p21在CKS2调控中具有不依赖p53的作用。ZNF687可作为转录因子结合CKS2启动子区域，CKS2是ZNF687的靶基因。ZNF687、CKS2可以激活c-Met的表达。CKS2可能可以通过调控PI3K/AKT信号通路促进肺腺癌细胞增殖、侵袭与转移。<br>　　（5）ZNF687 作为转录因子靶向癌基因CKS2激活 c-Met /PI3K/AKT 通路促进肺腺癌增殖、侵袭与转移。干扰ZNF687 后可以抑制癌基因CKS2 的转录，进而通过抑制c-Met /PI3K/AKT 通路降低肺腺癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力。