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摘要前列腺癌（Prostatecancer，PCa）是男性最常见的恶性肿瘤之一，目前前列腺癌已经成为男性泌尿系统恶性肿瘤中发病率排名第一的癌症。根据2020年全球癌症统计数据，前列腺癌占所有男性癌症的约13.6%，是男性癌症死亡的第四大原因，占男性癌症死亡的约7.1%。在美国，根据美国癌症协会（AmericanCancerSociety，ACS）的数据，估计2023年将有约288,300名男性被诊断出前列腺癌，约34,700名男性死于前列腺癌。<br>　　昼夜节律基因是控制人体昼夜节律的基因，以适应地球的自转周期。这些基因编码了蛋白质，它们构成了生物钟的核心，这个核心负责调节一系列生理过程，如睡眠－觉醒周期、体温和代谢率等。目前已经发现了一系列昼夜节律基因，包括CLOCK、BMAL1、PER1、PER2、PER3、CRY1、CRY2、CSNK1D、CSNK1E、NR1D1、RORA、NR1D2和RORB等。这些基因通常以负反馈回路的形式调控相关基因的表达，它们编码的蛋白质能够抑制它们自己的表达，从而形成周期性的表达模式。研究表明，生物钟的紊乱与多种疾病的发生有关，包括肥胖、糖尿病、心血管疾病、精神疾病以及癌症等。<br>　　昼夜节律对前列腺癌有一定的影响。研究表明，昼夜节律紊乱可能会增加前列腺癌的风险，如夜班工作可能会打乱人体的生物节律，从而增加前列腺癌的发生率。前列腺细胞的昼夜节律基因与癌症的发生和发展密切相关，如CLOCK和BMAL1基因的表达在前列腺癌组织中明显下降。这可能会导致前列腺细胞的生物节律失调，从而促进肿瘤的生长和扩散。此外，昼夜节律基因的突变也与前列腺癌的风险增加有关，如PER1和PER2基因的突变被认为是前列腺癌的潜在风险因素，这些基因的突变可能会导致昼夜节律紊乱、DNA损伤修复异常以及细胞周期的改变。<br>　　最近有研究表明，miRNA与昼夜节律之间存在着复杂的相互作用关系。miRNA是一类长度约为22个核苷酸的非编码RNA，其作用机制复杂，目前研究比较多的是通过与靶基因mRNA的3’UTR结合，以调控目标基因的表达。昼夜节律基因的表达和miRNA的表达存在周期性的变化，它们之间可能存在着相互调节的关系。研究发现PER2能够抑制miR-183的表达，从而影响视网膜色素上皮细胞的功能；而一些miRNA也能够影响昼夜节律基因的表达，如miR-132和miR-212能够调控CLOCK基因的表达，从而影响昼夜节律的调节。对这种相互作用关系的深入研究有助于更好地理解生物节律和调节机制的复杂性，并有可能为预防和治疗与生物钟有关的疾病提供新的思路和策略。<br>　　miRNA与前列腺癌的关系已经得到了广泛的研究，miRNA在前列腺癌的发生发展、诊断、治疗以及预后评估中都具有重要作用。深入研究miRNA与前列腺癌的关系，将有助于更好地理解前列腺癌的分子机制。<br>　　目前对昼夜节律基因与前列腺癌发生发展的关系还需要进一步的研究。虽然已经发现了一些相关的基因和生物发展过程，但是具体的调节机制和相互作用关系还需要更深入地探究。对于预防和治疗前列腺癌，深入了解这种关系对于制定更有效的预防和治疗策略也具有潜在的价值。<br>　　第一部分：核心昼夜节律基因的表达水平与前列腺癌预后的关系<br>　　目的：通过生物信息学技术挖掘公共数据库以试图进一步阐明核心昼夜节律基因的表达水平在前列腺癌预后预测中的重要作用。<br>　　方法：（1）从癌症基因组图谱数据库（TheCancerGenomeAtlas，TCGA）和基因表达综合数据库（GeneExpressionOmnibus，GEO）中收集了605例前列腺癌患者，分别对每个昼夜节律核心基因进行生存分析。（2）用Cox回归分析考察核心昼夜节律基因的预后能力，提取独立的预后特征，建立基于核心昼夜节律基因的风险预后评分模型。（3）探索TCGA训练集和独立GEO数据集中风险评分模型的预测能力。（4）评估了核心昼夜节律基因的风险预后评分模型与临床病理参数、生物学过程和信号通路之间的关系。<br>　　结果：（1）核心昼夜节律基因的表达水平与前列腺癌患者年龄、肿瘤分期、淋巴结转移、无病生存期（DFS)、无进展生存期（PFS）和总生存期（OS）广泛相关。（2）9个核心昼夜节律基因，包括CSNK1D、BTRC、CLOCK、CSNK1E、FBXL3、PRKAA2、DBP、NR1D2和RORB，被确定为前列腺癌的重要预后因素，并用于构建基于生物钟的风险评分模型。（3）对于DFS,3年或5年受试者特征曲线下的面积在0.728-0.821之间，具有更好的预测能力。（4）与T3-4N1期相比，T2N0期前列腺癌患者可能更受益于基于核心节律基因的风险评分模型。（5）此外，较高的风险评分与较短的DFS(p＜0.0001)，早期进展（p＜0.0001)，以及更高的前列腺癌的5年死亡率（p=0.007）有关。（6）核心昼夜节律基因风险评分与原发肿瘤状况相关（p＜0.001)，淋巴结转移状态（p＜0.001)，以及核糖体相关的生物合成信号通路有关。<br>　　结论：核心生物钟基因表达水平在临床中有重要的作用。我们建立的基于核心昼夜节律基因的风险评分模型可以反映和预测前列腺癌患者的预后，丰富了前列腺癌预后的评价内容。<br>　　第二部分：昼夜节律相关miR-6883-5p通过靶向作用AR-V7抑制恩杂鲁胺耐药前列腺癌<br>　　目的：前列腺癌的发病率逐年上升，去势抵抗性前列腺癌（CastrationResistantProstateCancer，CRPC）的治疗尤为棘手，恩杂鲁胺（Enzalutamide）等新型内分泌治疗药物也面临着耐药问题。我们之前的工作已经确定了昼夜节律基因的表达与前列腺癌预后的关系，在研究过程中发现昼夜节律基因PER1可以转录一种特殊的miRNA，miR-6883-5p，因此我们对miR-6883-5p的功能进行进一步探索，确定其在前列腺癌和昼夜节律调节中的重要作用。<br>　　方法：（1）通过GEPIA（GeneExpressionProfilingInteractiveAnalysis）数据库分析了PER1在前列腺癌患者和正常前列腺组织中的表达差异；通过GEO数据库分析了miR-6883-5p在前列腺癌患者和非前列腺癌人群中血浆中的表达差异。（2）收集6个前列腺癌患者的新鲜前列腺组织标本，提取组织RNA，通过RT-qPCR检测前列腺癌组织与正常组织内PER1和miR-6883-5p的表达量的差异；培养22Rv1、LNCaP与C4-2三种前列腺癌细胞系和一种正常前列腺组织细胞系RWPE1，提取相应的RNA，通过RT-qPCR检测其PER1和miR-6883-5p的表达量的差异。（3）利用miRWalk、TargetScan、miRanda在线靶基因预测网站预测出miR-6883-5p的靶标基因；并且使用RNA22v2和TransmiRv2.0数据库确定了miR-6883-5p对CLOCK、AR-V7的靶标位置；根据靶标结合位置，构建Clock和AR-V7相应的双萤光素酶报告基因质粒。（4）将miR-6883-5p模拟物与双萤光素酶报告基因质粒共转染至293T细胞中，24小时后提取相应的荧光蛋白，用酶标仪测试其发光强度。（5）将LNCaP和C4-2细胞培养基中加入10~40μmol/L的恩杂鲁胺培养6个月，构建恩杂鲁胺耐药前列腺癌细胞系。（6）将miR-6883-5p模拟物和其对应的乱序miRNA分别转染至恩杂鲁胺耐药细胞系内培养，相应提取其RNA、蛋白质，通过qPCR、WeternBlot检测相应的AR-V7的转录组和蛋白表达水平。（7）将miR-6883-5p模拟物、乱序miR-6883-5p与AR-V7过表达质粒分组转染至耐药细胞系内，通过细胞增殖实验和克隆增殖试验确定了miR-6883-5p对AR-V7的靶向抑制作用。（8）将培养成功的耐药C4-2细胞命名为C4-2EnzR，并种植到12只雄性裸鼠前背部皮下，1周后待肿瘤生长至皮下可见，向实验组小鼠肿瘤内注射miR-6883-5p，对照组注射相应乱序的miRNA，观察记录肿瘤生长情况。（9）建立Bmal1和Clock过表达质粒，转染前列腺癌细胞系确定，qPCR测定miR-6883-3/5p表达量，确定miR-6883-5p是否受到PER1转录因子的调控。（10）将miR-6883-5p转染至Bmal1荧光蛋白的U2OS-Luci细胞内，将细胞放到LmiCycle机器内检测其荧光强度周期。<br>　　结果：（1）昼夜节律基因PER1在前列腺癌中下调并与前列腺癌的不良预后相关。（2）PER1基因转录出的miR-6883-3p/5p在前列腺癌中表达水平较低，前列腺癌患者血清中miR-6883-5p的表达较低，且具有临床意义。（3）miR-6883-5p通过靶向结合AR-V7抑制恩杂鲁胺耐药前列腺癌细胞的增殖。（4）miR-6883-5p可靶向结合Clock，且能够延长细胞昼夜节律周期的相位。（5）miR-6883-3p/5p受PER1相关转录因子Clock和Bmal1的调节。（6）Bmal1与Clock可通过促进miR-6883-5p的表达来抑制前列腺癌细胞的增殖。（7）在体内，miR-6883-5p也能够抑制恩杂鲁胺耐药前列腺癌的生长。<br>　　结论：昼夜节律基因PER1和其转录的miR-6883-5p在前列腺癌内表达均较低，且具有临床意义。miR-6883-5p可以通过靶向结合AR-V7，在体内外均能抑制恩杂鲁胺耐药前列腺癌的增殖。Bmal1与Clock作为转录因子可以促进PER1和miR-6883-5p的表达，而miR-6883-5p可以靶向结合Clock，且能够调控昼夜节律周期相位。