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摘要目的：<br>　　周围神经缺损是一种临床常见的具有高致残率的创伤性损伤，严重影响患者的生活质量。临床常用治疗手段如桥接术等尚未达到期待的修复效果，因此需辅以其他的治疗方法如药物的干预。中国传统的复方中药因其多靶标综合干预的优势在神经损伤修复方面表现出极大的应用潜力。本课题组多年来致力于中药促神经生长和神经损伤修复研究，并以中医理论为指导，开发研制了一种中药复方制剂-神经再生冲剂（专利申请号：202010697245.X）。本研究（1）采用大鼠坐骨神经夹伤模型，通过行为学、形态学等方法研究神经再生冲剂对神经损伤修复的效应；（2）通过高通量基因组测序和生物信息学分析，构建“周围神经损伤后的动态基因表达网络”和“神经再生冲剂—有效成分—疾病多级网络”，进行比对和关联分析，并对网络中部分候选的枢纽基因进行了功能学验证；（3）围绕神经再生冲剂“益气补血，补益五脏，通经活络”的复方特征，构建髓鞘形成、抗凋亡、免疫调控、血管化等多个生物学功能子网络，尝试从多靶标系统化、生物功能模块化、子网络交互化的创新角度探索该复方制剂对周围神经损伤修复的效应机制，为神经再生冲剂的多靶点作用机理提供新现代化研究内容，揭示复方中药促进周围神经损伤后修复的科学理论。<br>　　研究方法：<br>　　1.建立大鼠坐骨神经夹伤模型。配制低、中、高三种浓度神经再生冲剂，通过灌胃方式给药，在给药后的不同时间点，采用CatWalk步态分析计算坐骨神经功能指数（Sciaticfunctionindex,SFI）、采用vonFrey法分析机械痛阈值（Pawwithdrawalthreshold,PWT）；取坐骨神经夹伤段组织进行透射电镜分析，观察髓鞘再生情况；对损伤后坐骨神经组织进行S100β和NF200免疫组织化学染色和大鼠复合肌动作电位（Compoundmuscleactionpotential,CMAP）分析，观察对轴突再生和神经功能的影响；采用腓肠肌湿重比和Masson三色染色分析中药对靶肌的影响。<br>　　2.通过中草药系统药理平台（TraditionalChineseMedicineSystemsPharmacology,TCMSP）数据库得到神经再生冲剂的有效成分表，通过Venn图展示、GO分析和KEGG分析，结合stringdb网站等数据分析潜在靶基因之间的互作关系，建立神经再生相关和免疫相关的PPI蛋白互作网络，按照功能聚类分析展示轴突再生、髓鞘形成、肌肉相关、血管再生四个子功能网络。通过CTD（ComparativeToxicogenomicsDatabase）、STITCH（SearchToolforInteractingChemicals）、TCMSP三个数据库，对五味主要中药组分的药物成分进行对应的靶基因搜索，并对其中与神经系统疾病相关基因进一步进行GO和KEGG分析。<br>　　3.建立大鼠坐骨神经夹伤模型，按前述有效药物浓度设给药组和对照组，于术后0d、12h、1d、3d、7d、14d取夹伤处组织进行转录组测序，筛选差异基因并对其进行功能注释及功能富集分析。构建周围神经损伤后不同时间点的动态差异表达基因网络，总结基因集群表达规律并对其中的hub基因进行筛选。对筛选得到的hub基因进行Real-timePCR和免疫荧光染色观察，验证转录组测序结果；最后采用siRNA在离体培养的DRG神经元中敲降Grin2b、Nefl、Prkca等候选基因，观察其对神经元轴突生长的影响。<br>　　结果：<br>　　1.Catwalk实验结果显示：术后给药2w，神经再生冲剂组SFI值显著高于对照组，中浓度药物组SFI值变化最大，在2w时差异有统计学意义。<br>　　针刺缩足实验结果显示：0-7d所有组别大鼠在所选vonFrey纤毛最大值100g时均无反应，2w时中浓度药物组的PWT有减小趋势，并于3w出现统计学差异。<br>　　电镜实验显示：2w、3w、4w时中浓度组大鼠术侧周围神经组织有髓神经纤维髓鞘板层数目和髓鞘板层厚度均大于对照组，在4w时差异有统计学意义。<br>　　坐骨神经组织S100β和NF200染色结果显示：术后给药1w时，给药组施万细胞的迁移距离和轴突生长均优于对照组，2w、3w、4w时给药组的施万细胞的密度和轴突密度大于对照组，荧光强度统计显示，给药组S100β和NF200表达较对照组强，各时间点差异有统计学意义。<br>　　术后给药2w，3w，4w测量CMAP振幅及运动神经传导速度的结果显示：给药组大鼠近、远端CMAP波幅大于对照组，其神经传导速度大于对照组。在3w时近端CMAP与对照组相比差异有统计学意义。<br>　　腓肠肌湿重比分析显示：术后给药2w、3w和4w，给药组大鼠湿重显著大于对照组，在4w时差异有统计学意义。<br>　　腓肠肌Masson染色实验结果显示：给药组的肌肉横截面积大于对照组，在1w时差异有统计学意义。<br>　　2.根据TCMSP数据库，神经再生冲剂的五味主要中药中有效化合物成分共计96种，潜在的药物成分靶基因共计430个。<br>　　对潜在靶基因进行GO分析结果显示：神经再生冲剂靶点主要与对含氧化合物的反应、细胞内信号转导、分子定位的调控、细胞坏死等生物过程（BP）相关条目，质膜组分、细胞连接、染色体等细胞组分（CC）相关条目，以及酶结合、蛋白多聚化、信号受体结合等分子功能（MF）相关条目具有高度相关性。<br>　　对潜在靶基因进行KEGG分析显示：可能的作用通路主要集中在免疫相关的C型凝集素受体信号通路（C-typelectinreceptorsignalingpathway）、IL-17信号通路（IL-17signalingpathway），细胞生存生长相关的凋亡（Apoptosis）、TNF信号通路（TNFsignalingpathway）、MAPK、PI3K-AKT通路，以及神经营养Neurotrophin信号通路等。<br>　　对潜在作用靶点进行PPI网络分析结果显示：互作网络中免疫相关、神经再生相关基因占比较大，且有较多功能重叠基因。将周围神经损伤修复的主要过程分为血管化、轴突再生、靶肌功能、髓鞘再生四类子功能模块，得到子功能PPI互作网络，显示作用靶点中与血管化功能相关31个、轴突功能相关23个、靶肌功能相关34个、髓鞘化相关3个基因。提示神经再生冲剂可能多靶点作用在血管化、轴突再生、靶肌功能重建、髓鞘再生等过程，为后续转录组测序提供了分析方向。<br>　　整合CTD、STITCH、TCMSP三个数据库查询结果，检索出药物各化学成分的作用靶点共计6961个。根据GeneCards及CTD数据库，获得神经系统疾病的相关基因1439个，经过对应分析显示五种药物靶基因中与神经系统疾病相关的基因数分别为白术245个，茯苓197个，枸杞子443个，牛膝91个，酸枣仁17个，共计993个。去重后进行GO和KEGG分析，结果表明：神经再生冲剂与神经系统相关疾病的相关靶点主要与对分子定位的调控、对外界刺激的反应、细胞凋亡、对含氧化合物的反应等生物过程相关条目，囊泡、细胞连接、外泌体等细胞组分相关条目，以及酶结合、阴离子结合、蛋白多聚化、信号受体结合等分子功能相关条目具有高度相关性。KEGG富集分析结果显示：神经再生冲剂可能作用通路主要集中在细胞凋亡、TNF信号通路、自噬等相关信号通路。在神经再生冲剂基因群中，免疫相关基因占比最高。<br>　　3.转录组测序结果显示：应用复方中药神经再生冲剂后，与对照组相比，给药组的差异基因与神经再生高度相关。随着损伤再生修复，血管化相关基因的数目增多，在2w时达到最多。损伤早期（12h至3d）免疫相关与血管化功能交叉基因多数上调，而在7d时上调和下调的基因数目相似，到14d总体下调数目远远多于上调数目，但在14d的cluster13中血管再生上调基因数目占比明显上升。轴突再生相关基因随着时间推移表达数目逐渐增多，且在14d达到高峰，随时间点变化上调基因逐步增多。肌肉相关功能基因表达动态变化在后期第14d中的高表达更为明显，且与细胞增殖和细胞迁移相关模块关联性高。通过高通量测序，我们挖掘到了更多与髓鞘化相关的基因在坐骨神经处的表达，如Mall，Tnfrsf1b，Ngfr等。且髓鞘化基因分布非常集中，基本只存在于与免疫、神经再生、细胞增殖和迁移等生物学功能相关的cluster5/7/13中。随时间变化的用药后基因表达变化动态网络图显示，给药后在早期免疫相关基因表达相对较少，后期尤其是损伤后14d，免疫相关基因表达出现上调。整个用药过程中，神经再生相关基因表达在中药组中明显高于对照组。<br>　　4.根据Real-timePCR结果，Adipoq、Grin2b、Nfe2、Nefl、Niacr1、Prkca等神经再生相关基因的表达水平与转录组测序结果基本一致，其中，Adipoq表达水平的免疫组化染色结果也与转录组测序结果一致。在离体培养的神经元中敲降Grin2b、Nefl、Prkca等基因，神经元最长轴突长度显著缩短。<br>　　结论：<br>　　1.复方中药神经再生冲剂能够有效促进坐骨神经运动感觉功能恢复，促进施万细胞的增殖和迁移，促进轴突的再生、髓鞘生成以及靶肌的恢复，且中浓度药物作用效果最佳。神经再生冲剂的促周围神经损伤后修复的作用可能与促血管化、促髓鞘化、促靶肌功能恢复、促轴突再生等相关过程有关，并对于神经-免疫微环境具有调节作用。<br>　　2.给予神经再生冲剂后，前期血管化主要与免疫微环境有关，而后期在免疫微环境趋于稳定后，主要是通过血管化起到促进组织恢复和神经再生的功能。神经再生冲剂促进轴突再生的作用主要集中在后期。在神经再生冲剂作用下，肌肉功能的早期维持和后期功能恢复与免疫微环境和神经再生情况相关。<br>　　3.神经再生冲剂的作用具有复方的多靶点特性，通过调控机体内如Adipoq、Grin2b、Nfe2、Nefl、Niacr1、Prkca等多个神经再生相关基因的表达，从而促进坐骨神经损伤后恢复。