检索历史 清除

摘要目的：探讨糖脂毒性环境中抑制lncRNA MALAT1的表达水平对人脐静脉内皮细胞（HUVECs）功能影响的分子机制研究。<br>　　方法：用葡萄糖（HG）和棕榈酸（PA）处理人脐静脉内皮细胞，建立体外糖脂毒性内皮细胞模型。实验分组：对照组（Control）、高糖高脂组（HG+PA）、高糖高脂+si-RNA对照组（HG+PA+si-RNA）、高糖高脂+MALAT1siRNA组（HG+PA+si-MALAT1）、高糖高脂+MAPK1siRNA组（HG+PA+si-MAPK1）。RT-qPCR分别检测MALAT1、MAPK1的mRNA表达水平。蛋白质印迹（Western blot）分别检测自噬相关蛋白：微管相关蛋白1A/1B-轻链3(LC3)、螯合体1(SQSTM1/p62)、苄氯素1（Beclin1）；线粒体融合分裂相关蛋白：视神经萎缩蛋白1（OPA1）、动力相关蛋白（DRP1）；凋亡相关蛋白：BCL-2相关X蛋白（BAX）、B细胞淋巴瘤（BCL-2）、半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶-3（Caspase-3）、剪切后活化的半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶-3（Cleaved Caspase-3）；通路相关蛋白：丝裂源活化蛋白激酶1（MAPK1）、磷酸化的丝裂源活化蛋白激酶1（p-MAPK1）、哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）、磷酸化的哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（p-mTOR）的蛋白表达水平。免疫荧光共聚焦定位检测自噬及溶酶体相关蛋白：LC3、溶酶体相关膜蛋白2(LAMP2)的荧光共定位情况。透射电镜观察内皮细胞中自噬溶酶体的数目。线粒体探针染色（Mito-tracker）检测线粒体形态。免疫荧光检测细胞内活性氧（ROS）的产生。流式细胞仪检测各组细胞的凋亡。细胞增殖及划痕实验检测不同时间点各组细胞的增殖及迁移能力；血管形成试验检测各组细胞中新血管形成的量。<br>　　结果：与Control组相比，HG+PA组、HG+PA+si-RNA组lncRNA MALAT1表达增加(P均＜0.001)、p-MAPK1的表达增加(P＜0.05)，p-mTOR的表达下降(P＜0.01)。与HG+PA+si-RNA组相比，HG+PA+si-MALAT1组LC3、P62的表达下降（P＜0.01、P＜0.05）；LC3和LAMP2蛋白的荧光共定位阳性颗粒增加(P均＜0.01)；溶酶体数目减少；ROS表达下降(P＜0.01)；线粒体融合蛋白OPA1表达水平增高(P＜0.05)；Cleaved-Caspase-3、BAX表达均下降(P均＜0.01)、BCL-2表达增加(P＜0.05)；细胞增殖、迁移、成管能力均增加(P均＜0.01)；p-MAPK1的表达下降(P＜0.05)，p-mTOR的表达上升(P＜0.01)；与HG+PA+si-RNA组相比，HG+PA+si-MAPK1组内皮细胞中p-MAPK1的表达下降，p-mTOR的表达上升(P均＜0.01)。<br>　　结论：抑制lncRNA MALAT1表达，可以降低糖脂毒性环境下内皮细胞中线粒体的自噬水平，减少内皮细胞的凋亡及改善内皮细胞的功能，可能与调节MAPK1/mTOR信号通路有关。