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摘要急性心肌梗死(Acute myocardial infarction，AMI)导致心肌细胞丧失和瘢痕形成，且无法逆转，是全球死亡和发病的主要原因之一，其预防及治疗已经成为医学界研究的焦点问题之一。骨髓间充质干细胞（Bone marrow mesenchymal stem cells, MSCs）通过向周围组织释放旁分泌因子，逆转心脏重塑，减轻心脏纤维化，改善心脏功能，是修复缺血心肌的可行方法。然而，静脉注射干细胞到达缺血心肌组织的效率不高，限制了MSCs疗法的有效实施。因此，改善干细胞归巢是干细胞移植领域的一项长期挑战。研究表明，超声靶向微泡破坏（ Ultrasound-mediated microbubble destruction, UTMD）可在毛细血管壁上形成孔隙，改变局部心肌微环境，从而促进移植干细胞从血管归巢至缺血心肌组织。然而，仅依靠UTMD进行MSCs移植治疗心肌梗死存在局限性，因为MSCs在体外扩增过程中趋化因子受体4（CXCR4）表达明显减少，迁移能力降低。以往研究发现PDGF-BB通过PDGFR-β以剂量和时间依赖的方式增强CXCR4的表达。PDGF-BB和PDGFR-β相互作用诱导PDGFR磷酸化，激活PI3K/AKT信号通路，参与细胞增殖、存活、运动和血管生成等一系列细胞过程。PDGF-BB 作为 PDGF 家族的重要成员，在MSCs的迁移、存活和抗凋亡中起着至关重要的作用。那么UTMD联合PDGF-BB预处理是否发挥协同作用，显著提高MSCs归巢，逆转心肌重构，改善心肌功能，提高移植MSCs的治疗效果。本研究拟：制备阳离子脂质微泡，评估阳离子脂质微泡理化特性及声学特性。构建大鼠AMI模型，利用UTMD介导PDGF-BB预处理的MSCs移植缺血心肌区，探讨UTMD联合PDGF-BB预处理是否显著提高移植MSCs对大鼠心肌梗死治疗效果，并阐明PDGF-BB预处理调控MSCs迁移和抗凋亡的分子机制。本研究包括以下两部分：<br>　　第一部分 阳离子脂质微泡制备及质量评估<br>　　目的：<br>　　⑴ 采用薄膜水化-超声振荡法制备最佳粒径阳离子脂质微泡<br>　　⑵ 评估阳离子脂质微泡特征、安全性、粘附能力及声学特性<br>　　方法：<br>　　⑴ 采用薄膜水化-超声振荡法制备普通脂质微泡（ NMBs ）和阳离子脂质微泡（CMBs），在成膜材料中加入DC-胆固醇使微泡表面带正电荷而构建CMBs；<br>　　⑵ 光镜、电镜下观察不同脂质微泡形态，血细胞计数板测定不同脂质微泡浓度，马尔文纳米粒径分析仪检测不同脂质微泡粒径、Zeta电位；<br>　　⑶ 光学显微镜和小动物荧光成像仪分别检测CMBs体外、体内黏附能力；CCK-8、HE染色分别检测CMBs体外细胞、体内动物毒性反应；通过体外、体内造影成像检测不同脂质微泡成像能力。<br>　　结果：<br>　　⑴ 光镜及透射电镜下观察，NMBs和CMBs呈球形，表面尚光滑，大小分布均匀；NMBs浓度、粒径及电位分别为（4.36 ± 0.48）×109/mL、（1071 ± 113）nm、（-2.56 ± 1.12）mV，CMBs浓度、粒径及电位分别为（4.28 ± 0.21）×109/mL 、（1036 ± 191）nm、（27.09 ± 3.09）mV，CMBs和NMBs平均粒径和浓度无统计学差异（Pgt;0.05），表面电荷比较有统计学差异（Plt;0.05）；CMBs 和 NMBs平均粒径在6h内保持稳定，然而12h时后明显增加（Plt;0.05）。同样，CMBs和NMBs浓度在制备6h内保持稳定，在12h后浓度明显下降（Plt;0.05）；<br>　　⑵ CMBs和NMBs细胞毒性较小，安全性较高，达到医学生物材料细胞毒性的国家标准。体外粘附实验显示CMBs组每高倍镜下微泡数量平均为（45±9）个， NMBs组每高倍镜下微泡数量平均为（7±3）个，与HUVEC细胞粘附的CMBs数量是NMBs的6.4倍，两组差距明显，具有统计学意义（Plt;0.05）；同样，体内粘附实验显示CMBs组荧光强度强于NMBs组，具有统计学差异（Plt;0.05）。体外造影成像显示 CMBs 组与 NMBs 组体外造影信号强度无明显差异（Pgt;0.05），但体内造影显示CMBs组信号强度较NMBs组高（Plt;0.05）。<br>　　结论：<br>　　本研究通过薄膜水化-超声振荡法制备的CMBs，其理化性质非常稳定，同时还具备粒径小、表面带正电荷的特征，因此表现出更强的血管内皮粘附和体内成像能力，为后面UTMD介导MSCs移植研究提供了重要的实验基础。<br>　　第二部分 UTMD介导PDGF-BB预处理的MSCs移植治疗大鼠AMI的作用及机制<br>　　目的：<br>　　⑴ 探讨UTMD联合PDGF-BB预处理是否显著促进MSCs归巢，增强MSCs对大鼠心肌梗死治疗效果；<br>　　⑵ 阐明PDGF-BB预处理促进MSCs迁移和活性的分子机制<br>　　方法：<br>　　⑴ 采用全骨髓贴壁法分离培养SD大鼠MSCs。光学显微镜观察细胞的形态学特点，流式细胞仪分析所得细胞表面标记物CD29、CD34、CD45及CD90表达；<br>　　⑵ 应用0、10、20、50和100 ng/mL PDGF-BB预处理MSCs 24 h后，细胞划痕实验和Transwell迁移实验检测PDGF-BB对MSCs迁移能力的影响, 确定PDGF-BB促进MSCs迁移最佳剂量，用于后续体外及体内实验。体外应用H2O2诱导建立MSCs凋亡损伤模型，最佳剂量PDGF-BB预处理MSCs 24 h后，流式细胞学检测MSCs凋亡情况，Western blot检测磷酯酰肌醇3激酶(PI3K)/蛋白激酶B (Akt)、细胞外信号调节激酶1/2 (ERK1/2) 蛋白、CXCR4及activated caspase-3表达，RT-PCR 检测抗凋亡蛋白 B 淋巴细胞瘤-2 (Bcl-2) 和 Bax 表达。应用PI3K/Akt抑制剂LY294002、CXCR4抑制剂AMD3100明确PDGF-BB促进MSCs迁移和抗凋亡的可能分子机制；<br>　　⑶ 应用DiR或GFP体外标记MSCs，建立SD大鼠AMI模型。为评估UTMD介导MSCs递送后体内分布及归巢情况，随机分为四组：(a) Sham组，尾静脉注射1 mL PBS； (b) MI组，尾静脉注射1 mL PBS；(c) MI-MSC组，尾静脉注射DiR或GFP标记的MSCs（2×106个/只）；(d) MI-MSC-UTMD组，尾静脉注射DiR或GFP标记的MSCs（2×106个/只），其中MI-MSC组在单纯超声辐照后行MSCs移植，MI-MSC-UTMD在UTMD后行MSCs移植；移植24 h后用小动物成像系统、RT-PCR 及流式细胞学检测 MSCs 在大鼠体内分布及心脏归巢情况；Western-blot检测缺血心肌SDF-1表达，明确UTMD促进MSCs归巢机制；<br>　　结果：<br>　　⑴ 第三代的细胞形态饱满，呈梭形生长，生长速度快，贴壁细胞融合 80%左右时，细胞分布规则，呈旋涡状；细胞表面抗原CD29和CD90阳性表达，其阳性率分别为98.2%和99.9%，CD34和CD45阴性表达，阳性率分别为0.2%和2.2%，表明分离的细胞为MSCs；<br>　　⑵ MSCs移植24 h后处死大鼠，取出心、肝、脾、肺和肾，小动物生物发光成像系统显示MSCs主要聚集在肺、肝、脾，其荧光强度明显高于心脏。然而，对心脏荧光强度的定量分析结果显示，MI-MSC-UTMD组比MI-MSC组高1.31倍(Plt;0.05)。RT-PCR 及流式细胞术结果显示，MI-MSC-UTMD 组移植的 MSCs数量明显高于 MI-MSC 组(Plt;0.05)。Western blotting 分析显示，与 MI 组和MI-MSC组相比，UTMD处理显著增加了SDF-1的表达(Plt;0.05)。加入SDF-1中和抗体后，MSCs向梗死心肌区归巢数目减少(Plt;0.01)；<br>　　⑶ 在MI后第3 d和第30 d，采用实时荧光定量PCR检测Sry基因表达，结果所示， Sham 组和 MI 组均未检测到 Sry 基因， MI-MSC-vehicle 组及MI-MSC-PDGF-BB组检测到Sry基因，但MI-MSC-PDGF-BB组中Sry的表达明显高于 MI-MSC-vehicle 组(Plt;0.05)；采用流式细胞术检测心脏中的 MSCs，结果显示 MI-MSC-PDGF-BB 组缺血心肌中的 GFP 阳性细胞明显多于MI-MSC-vehicle组(Plt;0.05)；荧光显微镜结果显示，Sham组和MI组均未见GFP阳性细胞，MI-MSC-Vehicle组仅见少量GFP阳性细胞。而在MI-MSC-PDGF-BB组中发现了大量的GFP阳性细胞(Plt;0.05)；<br>　　结论：<br>　　UTMD联合PDGF-BB预处理可进一步提高移植MSCs治疗效果；PDGF-BB预处理通过PI3K/Akt通路和CXCR4激活增强MSCs迁移和活性，进而促进缺血心肌修复；UTMD联合PDGF-BB预处理可能为MSCs治疗AMI提供一种新的移植策略。