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摘要研究背景：嵌合抗原受体-T（ChimericAntigenReceptorT,CAR-T）细胞疗法是近年来兴起的一种被动细胞免疫疗法，主要用于治疗血液肿瘤，在实体瘤中因其复杂的肿瘤微环境导致其治疗效果较差。结直肠癌（ColorectalCancer，CRC）是世界范围内常见的恶性肿瘤，主要治疗方法包括手术切除，免疫疗法等。越来越多的研究表明，结直肠癌患者对CAR-T细胞疗法产生治疗抵抗。脂多糖（Lipopolysaccharide,LPS）是一种革兰氏阴性细菌细胞壁的成分，在结直肠癌患者中浓度很高。我们提出LPS是否是导致结直肠癌患者对CAR-T细胞疗法产生治疗抵抗的原因，目前其内在机制有待进一步研究。<br>　　研究方法：<br>　　（1）在体内实验中，采用异种移植模型，第一天通过尾静脉注射向NOD-scid小鼠注射0.5mg/kgLPS，第二天通过尾静脉注射2×106COLO205细胞，第三天继续通过尾静脉注射1×107CAR-T细胞。进一步通过体外实验CCK8、活细胞成像和WesternBlotting实验探究LPS影响结直肠癌细胞对CAR-T细胞治疗抵抗的机制。<br>　　（2）在体内实验中，采用异种移植模型，实验第一天将1μg/mLLPS预处理24h的2×106COLO205细胞经尾静脉注射到裸鼠体内，24h后通过尾静脉注射1×107CAR-T细胞。通过小动物活体成像观察裸鼠体内的细胞轨迹。体外实验中，通过克隆形成和成球实验观察LPS预处理24h后COLO205细胞干性的影响。通过qRT-PCR实验、WesternBlotting实验和免疫荧光染色观察LPS对干性相关基因（包括CD44、SOX2和NANOG）表达的影响；利用TGF-β1抑制剂和MYD88抑制剂探究LPS诱导COLO205细胞干性增强和对CAR-T细胞治疗抵抗的机制。利用TCGA数据库分析了MYD88与TGFB1之间的相关性，以及TGFB1与干性相关基因之间的相关性。<br>　　（3）在体内实验中，采用异种移植模型，实验第一天将2×106COLO205细胞经尾静脉注射到NOD-scid小鼠体内，24h后通过尾静脉注射1×107CAR-T细胞或经1μg/mLLPS预处理48h的1×107CAR-T细胞。在体外实验中，通过转录组测序富集到衰老相关信号通路。通过SA-β-gal染色实验探究LPS对CAR-T细胞衰老的影响，通过WesternBlotting实验探究LPS对CAR-T细胞中衰老相关基因P16、P21表达的影响。利用p38-MAPK抑制剂和MYD88抑制剂探究LPS诱导CAR-T细胞衰老和结直肠癌细胞对CAR-T细胞治疗抵抗的机制。<br>　　研究结果：<br>　　（1）体内实验表明LPS能够诱导结直肠癌细胞对CAR-T细胞治疗抵抗。体外CCK8实验观察到1μg/mLLPS诱导结直肠癌细胞对CAR-T细胞治疗抵抗能力最强，活细胞成像实验观察到LPS处理后COLO205细胞凋亡减少，WesternBlotting实验观察到LPS处理后，COLO205细胞的凋亡相关基因Cleaved-CASPASE3和BAX表达下调。<br>　　（2）裸鼠体内实验和体外实验均表明，LPS预处理结直肠癌细胞后，可诱导结直肠癌细胞对CAR-T细胞治疗产生治疗抵抗。LPS可通过上调CD44、SOX2和NANOG增强COLO205细胞的干性。使用TGF-β1抑制剂进行的反向干扰实验表明，LPS诱导结直肠癌细胞TGF-β1自动分泌在增强结直肠癌细胞干性的过程中发挥了关键作用。TCGA数据库分析显示，MYD88与TGFB1之间存在很强的正相关性。此外，TGFB1还能上调干性相关基因的表达。进一步的机制研究表明，TLR4/MYD88通路可调节LPS诱导的TGF-β1表达。我们的研究结果表明，LPS通过增强结直肠癌细胞干性诱导结直肠癌细胞对CAR-T细胞治疗抵抗。TLR4/MYD88信号通路依赖的TGF-β1表达参与了干性增强和对CAR-T细胞治疗抵抗。<br>　　（3）体内实验和体外实验均表明，LPS预处理CAR-T细胞后可诱导结直肠癌细胞对CAR-T细胞治疗产生治疗抵抗。LPS可通过上调衰老相关基因P16、P21的表达诱导CAR-T细胞衰老。使用p38-MAPK抑制剂进行的反向干扰实验表明，LPS激活p38-MAPK信号通路在LPS诱导CAR-T细胞衰老过程中发挥了关键作用。进一步的机制研究表明，TLR4/MYD88通路可调节LPS诱导的p38-MAPK信号通路。研究结果表明，LPS通过诱导CAR-T细胞衰老导致结直肠癌细胞对CAR-T细胞治疗抵抗。TLR4/MYD88/p38-MAPK信号通路参与了CAR-T细胞衰老和结直肠癌细胞对CAR-T细胞治疗抵抗。<br>　　研究结论：一方面LPS通过TLR4/MYD88/TGF-β信号促进结直肠癌细胞干性导致结直肠癌细胞治疗抵抗，另一方面LPS通过TLR4/MYD88/p38-MAPK信号通路诱导CAR-T细胞衰老导致结直肠癌细胞对CAR-T细胞治疗抵抗。我们的研究结果有助于理解结直肠癌细胞对CAR-T细胞产生治疗抵抗的潜在机制并为其提供了新的思路。