检索历史 清除

摘要果胶酸裂解酶（PL）作为果胶酶家族中的一员，通过β-消除机制可以有效地将果胶分解成4,5-不饱和寡聚半乳糖醛酸。果胶酸裂解酶能够有效脱去苎麻原麻中的胶质，制取苎麻纤维。与传统的碱性脱胶工艺相比，酶法脱胶具有效率高、条件温和、对环境友好等优点。在果汁澄清方面，果胶酸裂解酶也具有应用前景。它能够帮助分解果汁中的果胶物质，降低果汁的粘度，促进果汁的澄清过程。同时，果胶酸裂解酶还能够影响果汁的口感和品质，增加果汁的透明度和稳定性。因此，筛选高效稳定的果胶酸裂解酶至关重要。<br>　　前期研究表明芽孢杆菌属基因组中含有果胶酶编码基因。在本论文中，首先以地衣芽孢杆菌基因组为模板，通过PCR扩增四个果胶酸裂解酶基因blipl1、blipl2、blipl3、blipl4；以多粘类芽孢杆菌基因组为模版扩增果胶酯酶基因ppopme；并将blipl1、blipl2、blipl3、blipl4分别与表达载体pET-22b(+)连接，ppopme与表达载体pET-28a(+)连接，转入大肠杆菌BL21（DE3）中构建重组菌。以IPTG对重组菌进行诱导表达，SDS-PAGE检测表达结果。结果表明BliPL1、BliPL3、BliPL4及PpoPME为可溶性蛋白，而BliPL2表达为包涵体。对可溶性表达蛋白使用镍亲和层析柱进行纯化。通过SDS-PAGE电泳检测透析后的四个重组酶BliPL1、BliPL3、BliPL4、PpoPME，其分子量分别为34kDa、46kDa、45kDa、37kDa，与预测结果相符。为提高BliPL2的可溶性表达，将其与五个分子伴侣在大肠杆菌中共表达，SDS-PAGE电泳检测后发现BliPL2与分子伴侣pG-KJE8共表达时为可溶性蛋白，其分子量为42kDa。酶活检测结果表明，以橘皮果胶为底物测得BliPL1和BliPL3的酶活分别为510.95U/mL与317.37U/mL；而BliPL4、包涵体复性后的BliPL2以及共表达的BliPL2-pG-KJE8均无果胶裂解酶活性。<br>　　由于BliPL1和BliPL3具有较好的果胶酸裂解酶活性，接下来对这两个酶的酶学性质和应用进行研究。以橘皮果胶为底物时，BliPL1的最适温度为70℃，在90℃条件下依然保留30%左右的活性，在20-40℃条件下孵育30min仍旧保留60%以上的活性。BliPL1最适pH值为11.5，在pH10.0-12.0范围内，相对酶活力能达到60%。在pH7.0-12.0范围内孵育24h仍能保留40%左右的残余酶活力。Ca2+是BliPL1的显著激活剂，当Ca2+添加量为0.01mM时，其酶活力是未添加Ca2+的1.4倍。动力学参数Km及Vmax分别为3.012mmoL/L和863.00μmol/mL/min；BliPL3最适反应温度为40℃，在70℃条件下依然保留50%左右的活性。在50-70℃条件下孵育60min仍旧保留15%以上的活性。BliPL3最适pH值为6.0，在pH5.0-9.0范围内，相对酶活力能达到60%。在pH5.0-9.0范围内孵育24h，BliPL3仍能保留50%左右的残余酶活力。当Ca2+添加量为1mM时，BliPL3的酶活力是未添加时的2.6倍。<br>　　经过BliPL1苎麻脱胶实验的研究发现，无论是单独使用酶还是与碱联合处理苎麻，纤维的重量都会有明显的减少。特别是当使用1U/mL的BliPL1与0.5%的NaOH进行联合处理时，纤维的重量损失与单独使用1%NaOH处理时存在显著差异。这一协同处理方法不仅有效降低了纤维的重量，还显著减少了化学试剂的使用量，为苎麻脱胶过程提供了更为环保和高效的解决方案。BliPL3在苎麻脱胶实验中，酶单独使用及联合使用都不及化学法减重效果好。BliPL1苹果汁澄清实验表明，碱性果胶酸裂解酶也可用于果汁澄清，最适酶添加量为25U/mL，酶解温度为65-70℃，酶解时间为1h，pH为苹果汁原始pH，在该条件下苹果汁澄清度可达到98%。BliPL3在果汁澄清实验中最适酶添加量为62.5U/mL，酶解温度为40-45℃，酶解时间为1.5h，pH为苹果汁原始pH，在此条件下苹果汁澄清度达到95%。本研究为果胶酸裂解酶的应用奠定了基础。