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摘要药物性肝损伤是药物常见的不良反应，也是导致药物研发失败和退市的重要因素。有研究统计了全球范围内被撤市的462种药物，其中因肝毒性退市的药物比例高达18%。然而，现有临床前肝损伤评价模型存在诸多局限性，如动物与人种属差异显著，以及细胞类型单一且缺乏免疫微环境等，这些因素限制了模型对药物肝损伤准确性的评估。为解决上述问题，本研究构建了一种新颖的肝微生理系统模型，该模型集成了多细胞类型和免疫微环境。这种微生理系统，也称为器官芯片，是近年来发展起来的一种新兴研究工具，它利用微流控技术精确模拟人体特定器官的复杂微结构、微环境和生理功能，从而实现对药物在体内反应的精确评估。本研究以免疫-肝器官芯片为核心，利用免疫-肝器官芯片开展了一系列药物肝损伤研究，具体工作如下：<br>　　第一部分：免疫-肝微生理系统的构建<br>　　本研究设计并构建了重力驱动的三通道免疫-肝微生理系统，包含肝细胞（HepG2细胞）与免疫细胞（THP-1巨噬细、HL-60中性粒细胞）的共培养，芯片内包含了间隔为200μm的微栅栏，以实现3个通道的有效阻隔，中央通道承载了肝细胞，而两侧通道则装载了免疫细胞。通过置于摆动摇床，利用重力驱动内部流体循环。分析显示，芯片内流体分布区域化，中央通道流速低，中间通道中的剪切力比两侧通道低约100倍，符合肝实质细胞受到的剪切力较窦间隙低几个数量级的情况，符合体内肝实质细胞的微环境特点。细胞活性及功能表达得到了有效表征。初步利用该芯片评估了曲格列酮与罗格列酮的肝毒性差异，发现免疫细胞的加入增强了曲格列酮的肝毒性，即在免疫-肝器官芯片上，曲格列酮在2.5倍血药浓度时（15μM）即表现出毒性，而在肝芯片上，浓度需要提高到25倍血药浓度以上。而对罗格列酮则无显著影响，展现了微生理系统在药物安全性评价中的潜在应用价值。<br>　　第二部分：免疫-肝微生理系统评价不同免疫细胞对曲格列酮肝毒性的影响<br>　　曲格列酮（Troglitazone, TGZ）是种用于治疗2型糖尿病的酮类药物，自1997年上市后，陆续有94例肝脏衰竭及63例患者死亡的临床报道，在2000年被多个国家撤市。曲格列酮在临床上显示出的严重肝毒性，并未在临床前的动物实验上体现出来。后续的研究表明，曲格列酮的临床肝毒性与免疫微环境有关。本章利用免疫-肝器官芯片方法，研究了不同免疫细胞（THP-1巨噬细胞、HL-60中性粒细胞、NK-92自然杀伤细胞）对曲格列酮的肝毒性影响。我们观察到了中性粒细胞在曲格列酮肝毒性过程中的趋化、粘附、杀伤作用，中性粒细胞可显著诱导15μM曲格列酮发生严重肝损伤：活细胞比例仅为对照组的45%。发现巨噬细胞的过量沉积会加大曲格列酮的肝毒性并伴随着大量炎症因子的释放，培养基中的促炎因子（IL-1β、TNF-α、IL-6）浓度上调，抑炎因子IL-10下调。确认了NK细胞对曲格列酮的肝毒性没有贡献，发现15μM曲格列酮能够抑制NK-92细胞对肝细胞的损伤，通过进一步的曲格列酮和NK-92细胞的共培实验，明确了曲格列酮能够抑制NK-92细胞的增殖。中性粒细胞的加入会导致芯片内炎症水平和活性氧水平的升高，而预先加入活性氧清除剂 N-乙酰半胱氨酸（N-Acetyl-L-cysteine, NAC），能够降低中性粒细胞与曲格列酮共同导致的肝损伤。进一步的研究发现，THP-1巨噬细胞和HL-60中性粒细胞在曲格列酮引起的肝损伤过程中能够相互促进，形成更强的免疫炎症环境，进一步加大肝损伤。免疫-肝器官芯片可以让我们确定不同类型的免疫细胞对曲格列酮的肝毒性影响，并观察到肝细胞损伤过程中动态多细胞参与的过程。<br>　　第三部分：免疫-肝微生理系统评价何首乌的肝毒性<br>　　近年来，何首乌肝损伤的相关不良反应报道频现，使其在临床用药中成为引发肝毒性最多的单一药材。已有的研究表明何首乌的肝毒性主要源于三个方面：大黄素等物质的直接肝损伤作用、顺式二苯乙烯苷和大黄素-8-O-β-D-葡萄糖苷引发的炎症应激肝损伤，以及易感基因介导的适应性免疫肝损伤。这表明，何首乌的肝损伤不仅与患者的个体特性有关，更与其复杂的物质组成密切相关。然而，由于何首乌的成分复杂且含量微量，对其中肝毒性物质的全面探索变得异常困难，从而无法构建以毒效成分含量为核心的化学质控方法。因此，开发能够反映何首乌毒效特征的生物质控方法显得尤为重要。<br>　　针对这一问题，我们利用免疫-肝器官芯片的独特优势，即能够反映肝区炎症水平，对比了何首乌醇提物在单独肝芯片和免疫-肝器官芯片上的肝毒性IC50值。结果显示，在免疫-肝器官芯片上，何首乌表现出了更强的肝损伤特性和更低的IC50值。这充分说明，免疫-肝器官芯片不仅能反映何首乌的直接肝损伤，还能准确反映其炎症应激肝损伤，因此可作为何首乌毒效生物质控的有效方法。<br>　　为了进一步验证这一结论，我们利用HPLC-UV方法定量测定了何首乌醇提物中的关键成分，包括大黄素、大黄素-8-O-β-D-葡萄糖苷、顺式和反式二苯乙烯苷，并复配了这些成分的定量组分。然而，实验结果显示，这些定量组分在肝芯片或免疫-肝器官芯片上均未能引起肝损伤。相比之下，同样条件下的何首乌醇提物在免疫-肝器官芯片上导致了35%的肝细胞损伤。这一结果一方面表明，何首乌醇提物中含有未知的炎症应激肝损伤成分，这进一步强调了构建何首乌肝毒性生物质控方法的必要性；另一方面，也凸显了免疫-肝器官芯片在反映何首乌肝毒性特性方面的灵敏性。因此，免疫-肝器官芯片无疑是何首乌肝毒性生物效应质控方法的理想选择，有望在保障何首乌用药安全方面发挥重要作用。