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迷走神经介导胃部痛觉信号传递的神经环路机制研究

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摘要研究目的： 　　胃部疼痛是一种常见胃肠道症状，降低患者进食欲望，且伴发疾病多样，严重影响患者生活质量。因其病理机制复杂，治疗手段短缺且疗效不佳，深入研究其病理机制，发现有效的治疗靶点和开发新的干预方法迫在眉睫。目前关于胃部疼痛的研究大多集中于周围神经系统的分子机制水平，而中枢神经环路如何介导胃部疼痛尚不清楚。上消化道，包括胃部，通过迷走神经和脊髓神经两大途径向中枢神经系统传递感觉信息。据报道，迷走传入神经主要传递生理信息，而脊髓传入神经则负责编码伤害性信息。胃部主要接受迷走传入神经支配，迷走神经作为十二对脑神经之一，在调节消化、心率、呼吸等方面扮演着重要角色。尽管已有电生理证据表明，迷走神经对胃部扩张（ Gastric distension，GD），特别是达到有害或疼痛范围的扩张有反应。然而，目前在大脑中，特别是在大脑皮层水平尚未绘制出迷走神经传递痛觉信号的完整上行神经通路，因此没有足够证据表明迷走神经可作为痛觉感受器转导胃部疼痛信息并最终在皮层形成疼痛感觉。鉴于此，本研究旨在探究迷走传入神经是否启动和传递有害GD刺激诱导的胃部疼痛信号，以及明确大脑中内源性内脏疼痛的上行传导神经环路。这项研究将为“胃-脑轴”的连接图谱提供新的证据，深化对胃部疼痛上行传导神经环路的理解，从而为胃部疼痛的临床治疗提供新的策略。 　　实验方法： 　　（1）胃-脑病毒示踪技术：使用1型单纯疱疹病毒（Herpes simplex virus 1，HSV-1）实现神经特异性顺行跨多突触追踪。 　　（2）胃部疼痛行为诱导及评估：通过 GD 刺激诱导小鼠产生胃部疼痛反应，并结合颈部斜方肌电信号（Electromyography，EMG）记录进行评估。 　　（3）免疫荧光染色技术：通过c-Fos染色技术筛选GD刺激激活的脑区及被激活神经元的类型；使用特异性神经元标志物染色鉴定神经环路投射的神经元类型。 　　（4）脑立体定位病毒注射技术：通过脑立体定位病毒注射技术在孤束核（Nucleus tractus solitarius，NTS）、外侧臂旁核（Lateral parabrachial nucleus，LPB）、丘脑室旁核（Paraventricular thalamic nucleus，PVT）及前边缘皮层（Prelimbic cortex，PL）脑区进行病毒注射。 　　（5）在体光纤钙成像技术：通过在体光纤钙成像技术实时检测GD刺激时NTS脑区、LPB脑区、PVT脑区及PL脑区神经元钙离子活动的变化以及干预神经环路时脑区神经元钙离子活动的变化。 　　（6）光遗传学技术：使用光遗传学技术操纵NTS、LPB、PVT及PL脑区神经元兴奋性及操纵神经环路进而检测小鼠胃部疼痛行为变化。 　　（7）化学遗传学技术：使用化学遗传学技术操纵NTS、LPB、PVT及PL脑区神经元兴奋性及操纵神经环路进而检测小鼠胃部疼痛行为变化。 　　（8）荧光探针技术：使用荧光探针技术结合光纤记录检测给予小鼠GD刺激时PL脑区谷氨酸递质的释放水平。 　　实验结果： 　　第一部分：胃-迷走神经-NTS谷氨酸能神经元神经通路鉴定 　　（1）通过在胃壁注射HSV病毒，发现NTS、LPB、PVT及PL等脑区存在荧光信号，表明这些区域的神经元与胃部具有投射关系。 　　（2）给予小鼠 GD 刺激显著增加胃部疼痛反应，EMG 记录的曲线下面积（Area under curve，AUC）与GD刺激压力呈正相关。 　　（3）GD刺激显著激活NTS脑区c-Fos表达，且激活的c-Fos主要与谷氨酸能神经元共定位。 　　（4）GD 刺激显著增加 NTS 脑区谷氨酸能神经元钙活动，膈下迷走神经切断术（Subdiaphragmatic vagotomy，SDx）后钙活动显著降低，而在胸5脊髓全横断术（Thoracic spinal cord transection at the T5 level，T5x）后给予GD刺激仍显著增加NTS脑区谷氨酸能神经元钙活动。 　　（5）光遗传抑制NTS脑区谷氨酸能神经元显著降低GD刺激时EMG的AUC；光遗传激活NTS脑区谷氨酸能神经元增加GD刺激时EMG的AUC，而在SDx后，激活NTS脑区谷氨酸能神经元不改变GD刺激时EMG的AUC。 　　第二部分：PL脑区谷氨酸能神经元参与感知胃部疼痛信号 　　（1）GD刺激显著激活PL脑区谷氨酸能神经元，增加谷氨酸能神经元钙活动。 　　（2）光遗传抑制PL脑区谷氨酸能神经元显著降低GD刺激时EMG的AUC；光遗传激活PL脑区谷氨酸能神经元增加GD刺激时EMG的AUC。 　　（3）SDx显著降低GD刺激时PL脑区谷氨酸能神经元钙活动；而T5x并不影响GD刺激时PL脑区谷氨酸能神经元钙活动。 　　（4）抑制NTS脑区谷氨酸能神经元可显著降低PL脑区在GD刺激下的c-Fos表达及PL脑区谷氨酸能神经元钙活动。 　　第三部分：LPB与PVT脑区是胃部疼痛信号从NTS传递至PL的关键脑区 　　（1）顺行及逆行不跨突触病毒示踪显示NTS脑区与PL脑区无直接投射，但NTS脑区对LPB与PVT有顺行投射。 　　（2）GD刺激显著激活LPB脑区及PVT脑区谷氨酸能神经元，且谷氨酸能神经元钙活动显著增加。 　　（3）通过光遗传技术操纵LPB脑区及PVT脑区谷氨酸能神经元显著改变GD刺激时小鼠EMG的AUC。 　　（4）分别抑制LPB脑区及PVT脑区谷氨酸能神经元，均显著降低PL脑区在GD刺激下c-Fos的表达及谷氨酸能神经元钙活动。 　　第四部分：NTS-LPB-PVT-PL谷氨酸能神经环路介导胃部疼痛行为 　　（1）顺行跨单突触病毒示踪显示NTS脑区与LPB脑区具有谷氨酸能神经投射，光遗传学激活NTS脑区谷氨酸能神经元投射至LPB脑区的神经末梢显著增加GD刺激时EMG的AUC，抑制这一投射AUC则显著降低。 　　（2）无论光激活还是光抑制NTS脑区投射至PVT脑区的神经末梢，均不影响小鼠GD刺激时EMG的AUC。 　　（3）顺行不跨突触结合顺行跨单突触病毒示踪技术鉴定了 NTS-LPB-PVT 谷氨酸能神经环路，且使用化学遗传学技术抑制该环路后显著降低EMG的AUC。 　　（4）顺行不跨突触结合顺行跨单突触病毒示踪技术鉴定了 LPB-PVT-PL 谷氨酸能神经环路，且使用光遗传学技术干预该环路后显著改变EMG的AUC。 　　（5）化学遗传学技术结合荧光探针检测技术显示抑制 NTS-LPB-PVT 谷氨酸神经环路后，PL脑区在GD刺激时记录的谷氨酸递质释放水平显著降低。 　　实验结论： 　　（1）NTS 脑区谷氨酸能神经元通过迷走神经而非通过脊神经参与编码小鼠胃部疼痛信号。 　　（2）PL 脑区谷氨酸能神经元通过迷走神经及 NTS 脑区谷氨酸能神经元参与感知小鼠胃部疼痛信号。 　　（3）LPB脑区与PVT脑区是胃部疼痛信号从NTS传递至PL的关键脑区。 　　（4）NTS-LPB-PVT-PL 谷氨酸能四级突触神经环路在胃部疼痛行为调控中发挥重要作用。