检索历史 清除

摘要胶质母细胞瘤是成人中最常见、最具侵袭性和最致命的脑肿瘤。常规的手术切除和术后放化疗治疗效果不佳，多种新兴的治疗如电场治疗、免疫治疗、溶瘤病毒等治疗潜力也有限。因此，寻找针对驱动胶质母细胞恶性生物学特性的分子靶点仍然是当前研究的重点之一。线粒体对胶质瘤的生长和发展至关重要。通过直接结合线粒体成分或间接影响线粒体功能来靶向胶质母细胞瘤在体外和体内模型中都已经显示出治疗的潜力。线粒体功能是由线粒体蛋白执行的，通过干预线粒体蛋白质稳态进而影响胶质母细胞瘤的线粒体功能可能是一个重要的治疗靶点，然而目前尚无相关研究。<br>　　蛋白质的翻译过程是产生功能蛋白的起始。近年来，随着各种高通量测序技术的发现，蛋白质翻译的过程中大量存在一种叫做核糖体翻译停滞的现象。细胞通过核糖体相关蛋白质量控制（RQC）机制来清除停滞产物。RQC复合体中的Rqc2会在新生多肽链的羧基末端（C）添加由丙氨酸（A）和苏氨酸（T）组成的CAT-tail序列将新生多肽链推出60S亚基隧道，完成泛素化而被降解。对于靶向线粒体的蛋白质发生翻译停滞后的RQC机制称之为线粒体多肽核糖体相关蛋白质量控制（mitoRQC）。mitoRQC同样会添加CAT-tail序列，通过两种方式来处理停滞产物。一种同样是通过胞浆泛素化途径进行降解。另外一种则通过共翻译机制进入线粒体中进行降解。在后一种情况下，mitoRQC在关键组分含缬草蛋白（VCP）/细胞分裂周期48（Cdc48）相关的线粒体应激反应蛋白1（Vms1）和Rqc2的相互作用下会添加合适长度的猫尾，促进多肽链进入线粒体中。这一过程中，猫尾序列的添加受到Vms1蛋白的负向调控。如果缺乏Vms1，猫尾序列的长度将变长，进入线粒体后会形成蛋白聚集体，引发蛋白毒性反应，导致线粒体功能障碍。在哺乳动物中，猫尾序列的形成及释放则是由Vms1的同源基因锚蛋白重复序列和含锌指结构域蛋白1（ANKZF1）调控的。鉴于mitoRQC对维持线粒体蛋白质稳态的重要性，我们对ANKZF1在胶质母细胞瘤细胞的作用及机制进行探讨，期望能够为胶质母细胞瘤的治疗提供新的靶点。<br>　　第一部分：胶质母细胞瘤细胞对靶向线粒体的翻译停滞蛋白的清除机制研究<br>　　目的：<br>　　1构建靶向线粒体的翻译停滞质粒，观察胞质中的靶向线粒体的蛋白发生翻译停滞后在胶质母细胞瘤细胞中是如何被清除的，为针对mitoRQC的研究提供实验基础。<br>　　2. 观察胶质母细胞瘤细胞中mitoRQC关键蛋白锚蛋白重复序列和含锌指结构域蛋白1 （ANKZF1）和核输出因子（NEMF）的表达情况，为在胶质母细胞瘤中合理干预mitoRQC提供理论依据。<br>　　方法：<br>　　1.通过体外构建靶向线粒体的翻译停滞质粒（NS-mtGFP）转染胶质母细胞瘤U251细胞观察U251细胞发生的mitoRQC过程。<br>　　2.使用H2O2干预U251细胞模拟氧化应激环境，观察NS-mtGFP在胞浆和线粒体内的分布。<br>　　3.通过Western blot观察mitoRQC关键蛋白ANKZF1和NEMF在胶质母细胞瘤细胞系中的蛋白表达情况。<br>　　4.利用人脑胶质瘤组织芯片对ANKZF1在不同级别胶质瘤中的蛋白表达情况进行免疫组化染色评分并分析ANKZF1高低表达与患者总体生存期之间的关系。<br>　　结果：<br>　　1.构建的外源性NS-mtGFP能够在U251细胞中成功表达。<br>　　2.NS-mtGFP能够通过mitoRQC机制进入U251细胞线粒体内。在细胞氧化应激情况下， NS-mtGFP胞浆泛素化程度降低，进入线粒体中增多。<br>　　3.在胶质母细胞瘤细胞系U87、U251、U118和U343细胞中ANKZF1蛋白表达显著升高，尤其以U87和U251细胞明显。NEMF在U87和U251细胞中蛋白表达也显著升高。<br>　　4.WHO分级中III/IV级胶质瘤患者的ANKZF1的蛋白表达强度显著强于I/II级患者。与ANKZF1低表达患者相比较，ANKZF1高表达患者的总体生存期显著缩短，差异具有统计学意义。<br>　　结论：<br>　　1.胶质母细胞瘤细胞中靶向线粒体的蛋白发生翻译停滞时，通过mitoRQC机制进入线粒体内是其重要的处理方式。<br>　　2.在胶质母细胞瘤细胞系和胶质瘤组织中，mitoRQC关键蛋白ANKZF1表达失调，其表达水平的高低能够提示患者总体生存期的长短。<br>　　第二部分：ANKZF1调控mitoRQC影响胶质母细胞瘤细胞线粒体蛋白稳态<br>　　目的：探讨NS-mtGFP对胶质母细胞瘤细胞线粒体蛋白稳态的影响，在此基础上进一步探索ANKZF1敲低对进入线粒体内的NS-mtGFP羧基末端的CAT-tail长度以及对细胞线粒体蛋白稳态的影响。<br>　　方法：<br>　　1.使用免疫荧光观察NS-mtGFP转染U251细胞后蛋白聚集体的生成情况。使用透射电镜观察U251细胞线粒体的形态变化和线粒体内的蛋白聚集体形成情况。<br>　　2.利用Western blot检测转染NS-mtGFP后， U87和U251细胞中线粒体未折叠蛋白反应（UPRmt）相关蛋白热休克蛋白60（HSP60）、线粒体热休克蛋白70（mtHSP70）和LON蛋白酶同源物1（LONP1）蛋白丰度的变化情况。<br>　　3.使用Western blot检测NS-mtGFP转染后，U87和U251细胞中ANKZF1和NEMF蛋白表达的变化情况。<br>　　4.在成功构建ANKZF1慢病毒敲低稳转株的基础上，转染NS-mtGFP后使用免疫荧光观察U251细胞中ANKZF1和线粒体标记物Tomm20的共定位情况以及U87和U251细胞内蛋白聚集体的生成情况。<br>　　5.利用Tunel检测在ANKZF1敲低的U87和U251细胞中转染NS-mtGFP后细胞的凋亡情况。<br>　　6.在ANKZF1敲低的U87和U251细胞中转染NS-mtGFP后，将线粒体与胞浆分离，利用低温高速离心，将得到的线粒体蛋白分成可溶性蛋白和不溶性蛋白聚集体，经Western blot检测蛋白聚集体中NS-mtGFP含量以及分子量的变化情况，以此表征ANKZF1敲低后，对加在NS-mtGFP羧基末端的CAT-tail形成的影响。<br>　　结果：<br>　　1.外源性NS-mtGFP转染U87和U251细胞后能够导致细胞内蛋白聚集体染色和U251细胞线粒体中团块状蛋白聚集体增多。<br>　　2.U87和U251细胞在转染NS-mtGFP后UPRmt相关蛋白HSP60、mtHSP70和LONP1蛋白表达水平显著升高。<br>　　3.U87和U251细胞在转染NS-mtGFP后ANKZF1和NEMF蛋白表达水平也显著升高。<br>　　4.U251细胞在转染NS-mtGFP后可以观察到ANKZF1和Tomm20发生的共定位。<br>　　5.ANKZF1敲低慢病毒转染U87和U251细胞后能够成功构建ANKZF1敲低稳转株。与对照组相比，在ANKZF1敲低的U87和U251细胞稳转株中转染NS-mtGFP后，细胞内的蛋白聚集体明显增多，细胞凋亡程度显著增加，线粒体不溶性蛋白聚集体中NS-mtGFP含量增多，分子量增加。<br>　　结论：<br>　　1.胶质母细胞瘤细胞内NS-mtGFP超载时能够引起线粒体蛋白稳态失衡。<br>　　2.ANKZF1的敲低能够使通过mitoRQC进入到线粒体内的NS-mtGFP羧基末端的CAT-tail过长，分子量增加。进入线粒体后加剧线粒体内蛋白聚集体的形成和细胞凋亡。<br>　　第三部分：ANKZF1对胶质母细胞瘤细胞的恶性生物学特性及线粒体功能的影响<br>　　目的：观察ANKZF1敲低后对胶质母细胞瘤细胞的增殖、侵袭、迁移以及对胶质母细胞瘤细胞线粒体功能的影响。<br>　　方法：<br>　　1.使用MTT、EDU和集落实验观察U87和U251细胞ANKZF1敲低组和空载体组增殖能力的变化。<br>　　2.使用划痕实验和Transwell实验观察U87和U251细胞ANKZF1敲低组和空载体组迁移和侵袭能力的变化。<br>　　3.使用 Seahorse 氧耗率检测 U87细胞 ANKZF1 敲低组和空载体组线粒体氧化磷酸化（OXPHOS）水平的改变，使用Seahorse 细胞外酸化率检测U87细胞ANKZF1敲低组和空载体组糖酵解能力的变化。<br>　　4.使用Mito-Tracker Red CMXRos标记线粒体，观察U87和U251细胞ANKZF1敲低组和空载体组线粒体膜电位的变化。<br>　　5.使用Tunel实验检测U87和U251细胞ANKZF1敲低组和空载体组细胞凋亡程度的变化。<br>　　结果：<br>　　1.经体外和体内实验证实ANKZF1的敲低可以抑制U87和U251细胞的增殖能力和裸鼠体内肿瘤的生长。<br>　　2.ANKZF1的敲低可以降低U87和U251细胞的迁移和侵袭能力。<br>　　3.ANKZF1 的敲低能够降低U87细胞的OXPHOS水平和增强U87细胞的糖酵解能力。<br>　　4.ANKZF1敲低后能够导致U87和U251细胞线粒体膜电位下降、细胞凋亡程度增加以及线粒体凋亡途径的激活。<br>　　结论：<br>　　1.敲低ANKZF1后能够显著的抑制胶质母细胞瘤细胞的增殖、迁移和侵袭。<br>　　2.敲低ANKZF1能够导致胶质母细胞瘤细胞线粒体呼吸明显受损、能量代谢异常、线粒体膜电位下降和线粒体凋亡途径激活。