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摘要目的：CD19 CAR-T细胞疗法使得许多B系恶性血液肿瘤患者从中获益，极大的提高了这些血液肿瘤患者的OS、EFS，然而，CD19 CAR-T治疗后CD19抗原阴性复发也是患者接受CAR-T治疗后复发的一大原因。因此为解决单靶点CD19 CAR-T治疗后抗原阴性复发，结合文献及课题组前期工作成果，本研究构建了一种能同时特异性靶向B淋巴细胞表面分子CD9和CD19的串联双靶向嵌合抗原受体慢病毒质粒分子（CD9xCD19-CAR）并制备了Tan 9-19-28z CAR-T、CD9LH-28z CAR-T、CD19-28z CAR-T和Mock-T细胞，检测Tan 9-19-28z CAR-T在体外细胞系靶抗原表达缺失的情况下是否能发挥一定的肿瘤杀伤效应及Tan 9-19-28z CAR-T与各种单靶点CAR-T细胞在体外对pre B-ALL细胞的杀伤作用以及在体内对白血病小鼠模型的治疗效果进行了比较。<br>　　方法：将CAR分子中能够特异性识别B系淋巴细胞白血病肿瘤细胞表面抗原分子CD9和CD19的单链可变区CD9LH-scFv和CD19-scFv串联起来，设计出相应的慢病毒CAR质粒分子，以三质粒系统（Pspax2、pMD2.G）共转染293T细胞，包装成慢病毒，感染激活后的健康供者来源的T淋巴细胞以制备双靶点Tan 9-19-28z CAR-T细胞。实验中以Mock-T为对照组，以CD9LH-28z CAR-T、CD19-28z CAR-T作为对比，比较双靶点CAR-T与各单靶点CAR-T的疗效。将Kasumi-1（CD9-/CD19-）、Nalm6（CD9+/CD19+）、敲除CD19的Nalm6（Nalm6-CD19KO）、敲除CD9的Nalm6 （ Nalm6-CD9KO ）、697、敲除 CD19 的 697 （ 697-CD19KO ）、敲除 CD9 的697(697-CD9KO)这些细胞系作为靶细胞分别与Mock-T细胞、Tan 9-19-28z CAR-T细胞、CD9LH-28z CAR-T细胞及CD19-28z CAR-T细胞共培养，体外检测不同CAR-T细胞对不同靶细胞的杀伤能力、在不同靶细胞刺激下的激活与脱颗粒能力和细胞因子分泌的水平。通过Nalm6-Amcyan细胞系构建B淋系白血病小鼠CDX模型，通过小鼠体重监测、生存曲线分析和小动物活体成像技术来检测Mock-T、Tan 9-19-28z CAR-T、CD19-28z CAR-T及CD9LH-28z CAR-T细胞在小鼠体内的抗肿瘤作用。<br>　　结果：我们通过重叠延伸PCR和分子克隆技术成功构建了Tan 9-19-28z CAR质粒分子，它可在T细胞表面稳定表达。将构建好的Tan 9-19-28z T细胞与Mock T、CD9LH-28z T、CD19-28z T细胞进行比较，我们发现对于Mock T细胞而言，无论是与哪种靶细胞共孵育，都不会有明显的杀伤、激活、脱颗粒标志物及细胞因子分泌；而另外三种CAR-T细胞在体外和其对应特异性靶点抗原细胞共培养后，均可表现出明显的细胞杀伤作用、激活能力及较高的细胞因子分泌水平，但对CD9-/CD19-的Kasumi-1细胞无明显的效应；这表明了CAR-T细胞只有在相应靶点抗原存在的条件下才能发挥效应功能。与各单靶点CAR-T细胞相比，Tan 9-19-28z双靶点CAR-T细胞有着相似或者稍弱的杀伤作用、激活能力、脱颗粒标志物及细胞因子分泌能力，这可能是因为双靶点CAR-T需要进行进一步的优化才能达到更好的效果。体内实验表明，Tan 9-19-28z T细胞能有效地清除白血病小鼠体内的Nalm6肿瘤细胞，它对肿瘤细胞的清除效率与单靶点CD9LH-28z T、CD19-28z T细胞相似。相对单靶点CAR-T细胞，串联的双靶点Tan 9-19-28z T细胞能稍延长白血病模型小鼠的生存。<br>　　结论：我们成功设计并构建了能同时特异性靶向B系两种特异性抗原分子CD9和CD19的Tan 9-19-28z T细胞，并分别通过体内外实验证明了它的有效性和可行性，理论上为解决单靶点CD19 CAR-T细胞治疗pre B-ALL后CD19抗原阴性复发提供了一种应对策略。