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摘要研究背景：<br>　　腹主动脉瘤（Abdominal aortic aneurysm，AAA）以腹主动脉扩张超过 1.5倍为特征，是一种发病隐匿、死亡率高的危重型心血管疾病，严重危害我国居民的身体健康。腹主动脉瘤形成的主要病理因素包括平滑肌细胞的表型转变和凋亡、炎症细胞的浸润、细胞因子的产生、细胞外基质的降解、氧化应激、血管新生及腔内血栓形成等。目前临床治疗腹主动脉瘤的重点依然是腹主动脉瘤破裂前的诊断和破裂后的血管内手术修复，但仍缺乏有效的药物治疗措施。因此，深入研究腹主动脉瘤形成和发展的分子机制，将有助于发现预防和治疗腹主动脉瘤的关键靶点。<br>　　轴突导向分子Semaphorin7A（SEMA7A）是Semaphorins家族第7类中的唯一成员，具有一个特殊的糖基磷脂酰肌醇（Glycosylphosphatidylinositol，GPI）锚定位点，通过与受体整合素β1（Integrinβ1）和丛蛋白C1（PLXNC1）结合在多种生理和病理过程中发挥重要作用。我们实验室最近对血液扰动流刺激的Sema7a 敲除及野生型小鼠颈动脉血管壁细胞进行单细胞转录组测序，发现SEMA7A 可能具有促进平滑肌细胞表型转变的功能。血管平滑肌细胞的表型转变是腹主动脉瘤发生发展的重要事件。那么，SEMA7A 是否通过参与平滑肌细胞表型转变介导腹主动脉瘤发生发展还尚不清楚。因此，本文探究了 SEMA7A在腹主动脉瘤发生发展中的作用及机制，发现血管平滑肌细胞SEMA7A通过其受体整合素 β1激活下游的 PDK1-SGK3信号通路促进平滑肌细胞表型转变，最终介导腹主动脉瘤的发生发展。<br>　　研究目的：<br>　　阐明轴突导向分子SEMA7A在腹主动脉瘤发生发展中的作用和机制，为腹主动脉瘤的预防及治疗提供重要的理论依据。<br>　　研究方法：<br>　　1. SEMA7A在腹主动脉瘤患者及小鼠腹主动脉瘤模型中的表达<br>　　（1）对 UKBB、PMBB、eMERGE、deCODE和 HUNT等数据库中 37214例欧裔和 2007 例非裔腹主动脉瘤患者与 694684 例健康对照的全基因组测序数据进行GWAS meta-analysis以寻找腹主动脉瘤患者基因组中SEMA7A遗传变异位点。<br>　　（2）对腹主动脉瘤患者和健康成人的腹主动脉组织进行免疫组化染色，检测SEMA7A在腹主动脉瘤中的表达情况。<br>　　（3）分别构建多种小鼠腹主动脉瘤模型，通过免疫荧光和免疫印迹检测SEMA7A在小鼠腹主动脉瘤模型中的表达。<br>　　2. Sema7a敲除对腹主动脉瘤发生发展的影响<br>　　磷酸钙和弹性蛋白酶诱导小鼠腹主动脉瘤模型。对 Sema7a敲除（Sema7a-/-）和对照（Sema7a+/+）小鼠分别构建磷酸钙和弹性蛋白酶诱导的腹主动脉瘤模型。14 天后，进行小动物超声，再进行主动脉分离和体式拍照，统计腹主动脉瘤最大直径；对小鼠腹主动脉瘤组织进行固定、脱水、包埋、切片，随后进行苏木素-伊红和维多利亚蓝染色。<br>　　3.平滑肌细胞、内皮细胞及髓系细胞特异性Sema7a敲除对腹主动脉瘤发生发展的影响<br>　　（1）为了明确腹主动脉瘤中 SEMA7A 的表达及定位，对小鼠腹主动脉瘤组织进行免疫荧光染色。观察血管组织中 SEMA7A 与内皮细胞标志物 CD31、平滑肌细胞标志物α-SMA和巨噬细胞标志物MOMA-2的共定位。<br>　　（2）为了探究血管平滑肌细胞、内皮细胞及髓系细胞特异性 Sema7a 敲除对腹主动脉瘤发生发展的影响，分别构建平滑肌细胞特异性 Sema7a 敲除小鼠（Sema7aflox/flox;Myh11-CreERT2） ， 内 皮 细 胞 特 异 性 Sema7a 敲 除（Sema7aflox/flox;Cdh5-Cre） 小 鼠 和 髓 系 细 胞 特 异 性 Sema7a 敲 除（Sema7aflox/flox;Lyzs-Cre）小鼠。磷酸钙造模，分别观察平滑肌细胞、内皮细胞、髓系细胞特异性Sema7a敲除对腹主动脉瘤发生发展的影响。<br>　　4. SEMA7A对平滑肌细胞表型转变的作用<br>　　（1）在体外分别使用磷酸钙刺激 Sema7a 敲除（Sema7a-/-）和对照 （Sema7a+/+）小鼠主动脉原代平滑肌细胞，进行普通转录组测序。用火山图展示差异基因数量，用热图展示差异基因相对表达水平，用 qPCR 对差异基因中与平滑肌细胞表型转变的相关基因进行验证。<br>　　（2）构建过表达 SEMA7A 人主动脉平滑肌细胞系；使用磷酸钙刺激Sema7a 敲除（Sema7a-/-）及对照（Sema7a+/+）小鼠主动脉平滑肌细胞；检测平滑肌细胞收缩型标志物及合成型标志物的表达。<br>　　（3）利用免疫荧光检测磷酸钙诱导的 Sema7a 敲除（Sema7a-/-）和对照（Sema7a+/+）小鼠腹主动脉瘤样本中平滑肌细胞收缩型标志物及合成型标志物的表达。<br>　　研究结果：<br>　　1. SEMA7A在患者腹主动脉瘤组织及小鼠腹主动脉瘤模型中高表达<br>　　（1）腹主动脉瘤患者基因组中SEMA7A的SNP位点rs11856835存在显著统计学差异（P=4.30×10-10）。<br>　　（2）与健康成人对照相比，SEMA7A在腹主动脉瘤患者组织中高表达。<br>　　（3）与生理盐水组相比，SEMA7A在磷酸钙诱导的小鼠腹主动脉瘤中表达显著升高，同时平滑肌细胞合成型标志物OPN表达也显著升高，而平滑肌细胞收缩型标志物Calponin1表达显著降低。<br>　　2. Sema7a敲除减弱磷酸钙诱导的小鼠腹主动脉瘤发生发展<br>　　（1）小动物超声和体式拍照显示 Sema7a 敲除显著降低磷酸钙诱导的小鼠腹主动脉瘤最大直径，不减弱弹性蛋白酶诱导的小鼠腹主动脉瘤最大直径；与对照（Sema7a+/+）小鼠相比，磷酸钙诱导的Sema7a敲除（Sema7a-/-）小鼠腹主动脉瘤组织弹力纤维断裂程度显著降低，弹性蛋白酶诱导的 Sema7a 敲除 （Sema7a-/-）小鼠不减弱腹主动脉瘤组织弹力纤维断裂程度。<br>　　3.平滑肌细胞特异性Sema7a敲除减弱小鼠腹主动脉瘤发生发展<br>　　（1）免疫荧光和三维重构结果显示，SEMA7A主要与平滑肌细胞标志物α-SMA 的表达存在共定位；磷酸钙刺激后，人主动脉平滑肌细胞和小鼠原代平滑肌细胞中SEMA7A表达显著升高。<br>　　（2）成功构建了平滑肌细胞特异性Sema7a敲除小鼠（Sema7aflox/flox;Myh11-CreERT2），内皮细胞特异性 Sema7a敲除小鼠（Sema7aflox/flox;Cdh5-Cre）和髓系细胞特异性 Sema7a 敲除小鼠（Sema7aflox/flox;Lyzs-Cre）。腹主动脉瘤造模后利用小动物超声和体式拍照均发现，与对照组（Sema7aflox/flox）相比，平滑肌细胞特异性Sema7a敲除减小腹主动脉瘤最大直径，而内皮细胞和髓系细胞特异性Sema7a敲除后不减弱磷酸钙诱导的小鼠腹主动脉瘤最大直径；并且维多利亚蓝染色发现平滑肌细胞特异性Sema7a敲除后可显著降低磷酸钙诱导的小鼠腹主动脉瘤组织弹力纤维断裂程度，而内皮细胞和髓系特异性Sema7a敲除不减弱磷酸钙诱导的小鼠腹主动脉瘤组织弹力纤维断裂程度。<br>　　4. Sema7a敲除抑制平滑肌细胞的表型转变<br>　　（1）磷酸钙刺激的小鼠主动脉原代平滑肌细胞转录组测序差异基因分析表明，与对照（Sema7a+/+）小鼠原代平滑肌细胞相比，Sema7a 敲除（Sema7a-/-）小鼠主动脉原代平滑肌细胞有119个基因显著上调，222个基因显著下调；其中 Sema7a 敲除后平滑肌细胞收缩型标志物如 Cnn1，Cnn3，Acta1，Actg2 等表达升高，而平滑肌细胞合成型标志物如Spp1，Ccl8，Nrp1，Mmp13，Eln等表达降低。进一步的 qPCR 结果展示，平滑肌细胞收缩型标志物如 Cnn1， Cnn3，Actg2 的表达显著升高，Acta1 的表达没有显著变化；平滑肌细胞收缩型标志物如Spp1，Ccl8，Nrp1，Mmp13，Eln表达显著降低。<br>　　（2）在蛋白水平上，与对照（Sema7a+/+）小鼠原代平滑肌细胞相比，磷酸钙刺激的Sema7a敲除（Sema7a-/-）小鼠原代平滑肌细胞中，SEMA7A表达水平显著降低，平滑肌细胞收缩型标志物Calponin1表达水平显著升高，平滑肌细胞合成型标志物 OPN表达水平显著降低；而 Sema7a 过表达人平滑肌细胞中，SEMA7A表达水平显著升高，平滑肌细胞收缩型标志物Calponin1表达水平显著降低，平滑肌细胞合成型标志物OPN表达显著升高。<br>　　（3）小鼠腹主动脉瘤免疫荧光染色表明，Sema7a 敲除显著提高平滑肌细胞收缩型标志物α-SMA平均表达水平，不影响合成型标志物OPN平均表达水平，显著降低OPN与α-SMA的比值。<br>　　结论：<br>　　本研究主要探讨了SEMA7A在腹主动脉瘤发生发展中的作用及分子机制。发现Sema7a基因的单核苷酸多态性位点rs11856835与腹主动脉瘤密切相关，且SEMA7A 在患者腹主动脉瘤组织及小鼠腹主动脉瘤模型中高表达。功能上，发现 Sema7a全身性敲除和平滑肌细胞特异性 Sema7a敲除均能抑制腹主动脉瘤的发生发展。机制研究发现，SEMA7A通过ITGB1激活PDK1-SGK3信号通路介导平滑肌细胞表型转变，促进腹主动脉瘤的发生发展。