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摘要武乡病毒（Wuxiang virus，WUXV）是2018年从中国山西省武乡县采集的中华白蛉中分离到的白蛉病毒属病毒，且流行范围不断扩大。WUXV能导致哺乳动物细胞BHK-21产生细胞病变效应（Cytopathic effect，CPE），还会导致新生乳鼠产生明显的神经系统症状和死亡。此外，有研究者在病毒分离地的人和鸡血清中检测到WUXV阳性中和抗体，表明WUXV可以感染人和鸡，对公共卫生存在潜在威胁。然而，我们对WUXV的流行病学、致病性和致病机制的知之甚微，为了调查WUXV的流行情况，开展流行病学研究，本研究建立了WUXV实时荧光定量RT-qPCR和RT-RAA分子生物学检测方法，还基于WUXV N蛋白建立了Western blot血清学检测方法，对病毒分离地的人和动物开展了血清学筛查。为了探究WUXV的致病性，本研究在细胞水平和小鼠水平上研究了WUXV对细胞和动物的易感性。最后，在细胞水平上初步探究了WUXV诱导炎症反应的机制。<br>　　1 建立WUXV分子学检测方法：RT-qPCR检测方法和RT-RAA检测方法<br>　　RT-qPCR检测方法：本研究利用针对WUXV S段设计的引物和探针，以不同病毒的核酸作为扩增模板检测其特异性，仅能检测到WUXV核酸。使用不同滴度病毒的核酸建立标准曲线，CT值与模板浓度具有良好的线性关系（R2=0.9969），且该方法最低可检测到1个PFU的病毒粒子。<br>　　RT-RAA检测方法：本研究利用针对WUXV S段设计的引物和探针，以不同病毒的核酸作为扩增模板检测其特异性，仅能检测到WUXV核酸。使用不同滴度病毒的核酸来评估灵敏性，最低可检测到10个PFU的病毒粒子。<br>　　用以上建立的两种方法对采集的白蛉标本进行了核酸筛查，两种方法检测结果一致。RT-qPCR检测方法对在传播媒介中开展针对WUXV的常规监测具有重要价值，也为后续实验提供检测工具。RT-RRA检测方法所需设备简单，反应速度迅速，可用于WUXV的快速筛查及现场检测。<br>　　2 在山西省人和动物的血清中检测出WUXV阳性抗体<br>　　为了解WUXV分离地人和动物的感染状况，本研究对WUXV的N蛋白进行了原核表达，利用纯化的重组WUXV N蛋白通过蛋白免疫印迹（Western blot，WB）方法，对中国山西省武乡县的人、犬、鸡血清中WUXV抗体进行了检测。结果显示，68.96%（20/29）的人血清标本为阳性；70.97%（22/31）的犬血清标本为阳性；52.78%（19/36）鸡血清标本为阳性。本研究结果表明山西省地区人群和动物中存在较普遍的WUXV感染，为病毒的预防提供参考依据。<br>　　3 WUXV在细胞上的生长动力学探究<br>　　为探究WUXV对不同细胞的感染性，本研究以WUXV感染了来源于鼠（BHK-21， N2A）、人（HEK-293T，SH-SY5Y）、犬（MDCK）、猪（PK-15）、猴（Vero）和鸡（DF-1）的细胞。结果显示，BHK-21、MDCK和PK-15细胞表现出明显的CPE；BHK-21、MDCK、PK-15、HEK-293T、N2A、SH-SY5Y和DF-1细胞感染后病毒滴度、病毒核酸含量和病毒N蛋白表达增加，表明WUXV在在7种细胞中复制；WUXV不在Vero细胞中复制。本研究测试了不同细胞系对WUXV的易感性，并为进一步研究潜在的病毒感染机制奠定了基础。<br>　　4 WUXV对小鼠的致病性研究<br>　　为了解WUXV对小鼠的致病性及致病机制，本研究以WUXV感染免疫功能正常的BALB/c小鼠和T细胞免疫缺陷的BALB/c裸鼠。感染WUXV的BALB/c小鼠中，除了体重减轻外没有发生致命性疾病；而感染WUXV的BALB/c裸鼠则出现明显的神经症状和死亡。两种小鼠的各组织脏器中均检测到病毒核酸，与BALB/c裸鼠不同的是，BALB/c小鼠血液中含有高水平的特异性中和抗体。血常规、组织器官的炎症因子mRNA检测以及病理切片结果均表明WUXV引起了严重的炎症反应。BALB/c小鼠主要在大脑和眼睛中检测到高水平的IL-1β、IL-6、IL-10；而BALB/c裸鼠中，大脑、心脏、肺脏、肾脏及卵巢多个脏器中均表达高水平的炎症因子。总之，本研究描述了WUXV对不同免疫状态小鼠的致病性，并为WUXV的致病机制研究奠定基础。<br>　　5 WUXV触发Toll-like receptors 5/9（TLR5/9）促进炎症因子释放的机制研究<br>　　鉴于上述研究结果，WUXV感染BALB/c裸鼠出现的临床症状可能是由于炎症反应引起的。为了探究WUXV感染细胞后是否会诱导炎症反应，本研究用WUXV感染BHK-21细胞，发现炎症因子显著升高。此外，病毒感染后NF-κB的转录水平和磷酸化水平显著上调，提示WUXV可激活细胞NF-κB信号通路。为了确定介导NF-κB激活的TLR受体，本研究检测了感染病毒后的TLR1~TLR9及其下游分子的表达，结果显示TLR5和TLR9的表达显著升高，此外PI3K和MyD88的表达也显著升高。为了进一步确定TLR5和TLR9在WUXV激活炎症通路中发挥的作用，分别使用TLR5和TLR9的特异性抑制剂抑制，结果显示，用抑制剂处理后，随着TLR5的表达降低，细胞中的IL-1β、IL-10、NF-κB、PI3K的表达也显著降低，TLR9也呈现相同的现象。这些结果表明TLR5和TLR9均在WUXV介导的炎症反应中发挥了作用。