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摘要类风湿关节炎(rheumatoid arthritis,RA)是一种主要累及关节的自身免疫性炎症性疾病，可伴全身多系统并发症，严重影响患者生活质量。目前临床治疗用药以传统抗风湿药物、小分子靶向药物和生物制剂等药物为主。然而，仍有部分患者病情容易复发，疾病得不到持续缓解。此外，现有用药存在并发感染、肿瘤等不良反应。因此，需要更加深入的了解RA的发病机制并挖掘更加有效的治疗靶点。目前认为，遗传因素和环境因素是RA发病的重要影响因素。其中，肠道微生态作为重要的环境因素之一，可与遗传因素、免疫微环境相互作用影响疾病发生发展。<br>　　目的：<br>　　本研究主要为探究肠道菌群通过调节巨噬细胞功能在RA中的致病机制。<br>　　方法：<br>　　1.小鼠共分为4组，分别为SPF-Control组、SPF-RA组、GF-Control组和GF-RA组，其中Control组为健康对照小鼠，RA组为疾病模型小鼠。分别对无特定病原体(Specific pathogen Free,SPF)级普通小鼠和无菌(Germ Free,GF)小鼠进行RA小鼠造模。16-20周龄雄鼠，用K/BxN小鼠来源血清100?l/只，每周1次腹腔注射。<br>　　2.无菌EP管收集小鼠新鲜粪便，冻存至-80℃待16s rDNA测序，通过生物信息学分析小鼠肠道微生物构成和物种丰度变化。<br>　　3.收集SPF-Control组(n=7)、SPF-RA组(n=8)、GF-Control组(n=6)和GF-RA组(n=8)小鼠的脾脏和踝关节组织，利用流式细胞术检测脾脏和关节组织的巨噬细胞细胞浸润水平。<br>　　4.RNA-seq测序：提取小鼠后肢骨髓来源巨噬细胞，提取骨髓来源巨噬细胞mRNA进行PCR扩增富集，建立文库。将扩增产物加载到微阵列芯片上，使用联合探针锚定聚合技术进行测序，利用高分辨成像系统对光信号进行采集、读取和识别，获得原始测序数据。通过生物信息学软件分析组间差异表达基因和功能通路富集情况。<br>　　5.利用q-PCR技术验证骨髓来源巨噬细胞差异基因和炎症因子mRNA表达情况。Western blot检测关键差异基因蛋白表达水平和NF-κB通路核心分子蛋白表达量变化。<br>　　结果：<br>　　1.与SPF-Control组小鼠对比，SPF-RA小鼠肠道微生态发生改变，厚壁菌门、疣微菌门水平增加，阿克曼菌属及肠乳杆菌等物种丰度显著升高。<br>　　2.SPF-RA组小鼠关节临床评分和关节病理损伤程度较其他组别小鼠显著增加，踝关节淋巴细胞浸润、软骨侵蚀，关节间隙变窄，骨质破坏。GF-RA组小鼠踝关节无骨质破坏，无明显炎症细胞浸润，关节间隙正常。<br>　　3.与其他各组小鼠相比较，SPF-RA组小鼠关节巨噬细胞M1极化水平增加，关节组织和外周脾脏单核细胞、中性粒细胞浸润水平均显著升高；但GF-RA组小鼠关节与脾脏组织中巨噬细胞、中性粒细胞和单核细胞浸润水平无明显变化。<br>　　4.小鼠骨髓来源巨噬细胞RNA-seq结果表明，相较于GF-RA组，SPF-RA组存在79个基因表达上调(包括Nbea、Bend6、Cth、Fosb、Chac1等)和163个基因表达下调。对上述79个上调基因进行GO分析，提示SPF-RA小鼠来源骨髓巨噬细胞ERK1/2通路调控、炎症反应及免疫细胞趋化和迁移、氨基酸生物合成等生物学过程明显富集。趋化因子激活、G蛋白偶联受体和趋化因子受体结合等细胞分子功能增强。KEGG功能通路分析显示，C型瘦素受体信号通路、细胞因子-细胞因子受体互作通路、IL-17信号通路及NF-κB信号通路等免疫炎症反应相关通路显著富集。<br>　　5.对比GF-RA组，SPF-RA组小鼠骨髓来源巨噬细胞中的半胱硫氨酸γ-裂解酶(Cystathionineγ-lyase,Cth/CSE)mRNA和炎症因子IL-1β、cxcl2mRNA表达上调，IL-6mRNA表达呈上升趋势。Western Blotting结果显示，相较于GF-RA模型小鼠，SPF-RA组小鼠关节组织中NF-κB信号通路p65蛋白表达量增加。<br>　　结论：<br>　　1.肠道菌群可诱导RA小鼠关节炎症状加重。<br>　　2.肠道菌群通过调控关节巨噬细胞极化介导RA小鼠关节炎症反应。