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摘要研究背景和目的：<br>　　骨关节炎(Osteoarthritis,OA)是一种普遍的退行性疾病，OA最重要的病理组织是软骨，其主要的病理变化在于软骨细胞在合成与降解细胞外基质（ExtraCellularMatrix，ECM）的过程中出现了失衡现象，同时伴随着软骨细胞的凋。因此，抑制OA进展的关键环节是抑制关节软骨的退化。灵芝酸A(GanodericacidA,GAA)是从灵芝提取的三萜类化合物，有广泛的药理作用，如抗菌、抗炎、抗氧化等作用。尽管GAA的药理特性已被广泛研究，但GAA缓解0A软骨退变的机制尚未阐明。我们的目标是更好地了解GAA对OA的治疗效果，并阐明其作用的潜在机制。<br>　　方法：<br>　　（1）IL-1β与软骨细胞共培养形成炎性损伤软骨细胞模型，通过进行内侧半月板切除手术（DMM）构建C56BL/6J小鼠骨关节炎模型。<br>　　（2）通过CCK-8检测GAA对软骨细胞和炎性损伤软骨细胞模型二者活力的影响。<br>　　（3）通过流式细胞术、免疫蛋白印迹技术、RT-qPCR检测GAA对软骨细胞凋亡、细胞外基质退变、炎症的影响。<br>　　（4）进行网络药理学相关分析(KEGG、GO分析)，找出相关交集靶点分析并结合现有文献研究后，预测GAA治疗骨关节炎的潜在靶点与机制。<br>　　（5）激活软骨细胞的内质网应激后，使用免疫蛋白印迹技术检测内质网应激关的生物标志物水平。<br>　　（6）使用分子对接技术和免疫蛋白印迹技术以验证GAA对NF-κB信号通路的作用。<br>　　（7）使用番红O-固绿(SO)快染、甲苯胺蓝（TB）染色和HE染色以评估小鼠OA模型膝关节软骨的病理学和组织学改变。使用免疫组化来检测软骨中细胞外基质分解酶MMP3各组的表达。<br>　　结果：<br>　　（1）在IL-1β的刺激下，软骨细胞的活力出现了一定程度的降低。与GAA共培养后，细胞活力明显上升。当建立C56小鼠的骨关节炎模型后，观察到其软骨表面变得粗糙不平，形态失去规则，且存在纤维断裂的现象，显示出软骨受到了严重的损伤。但在经过GAA的注射治疗后，软骨的损伤情况得到了明显的改善。<br>　　（2）CCK8实验结果显示在IL-1β与GAA共干预软骨细胞条件下，GAA在50uM及以下浓度时，软骨的细胞活性较好。因此将探究GAA作用机制的浓度区间定为25-50uM。<br>　　（3）流式细胞术显示GAA能明显抑制IL-1β介导的软骨细胞凋亡。免疫蛋白印迹技术、免疫荧光及qRT-PCR的结果显示GAA通过对凋亡相关因子表达(Bcl-2,Bax,caspase3)、细胞外基质相关因子表达（Aggrecan，Collagenll，SOX9，ADAMTS5，MMP3，MMP13）、炎症相关因子表达(COX2、iNOX)的调控抑制了软骨细胞的炎症、凋亡及细胞外基质的降解<br>　　（4）通过网络药理学及现有文献研究结合分析，确定在下一步研究中探究GAA通过对内质网应激及NF-κB信号通路的调控缓解骨关节炎。<br>　　（5）使用内质网应激的常见的诱导因子thapsigargin(TG)激活软骨细胞应激，免疫蛋白印迹技术分析表明，TG处理显著提高了内质网应激相关生物标志物GRP78、ATF4和CHOP水平，GAA处理部分消除了这些标志物上调的表达。<br>　　（6）分子对接结果显示GAA能够和和p65具有稳定的相互作用和较强的结合亲和力(一6.8kcal/mol)。免疫蛋白印迹技术分析表明，IL-1β的干预作用并不影响p65的总表达，却导致了p-p65的表达上调，IκBA的表达降低。GAA的处理在p-p65的表达中表现出较强的抑制作用，而在IκBA分解代谢中表现出延迟作用。<br>　　（7）与假手术组和GAA组相比，DMM组小鼠膝关软骨明显严重受损，其Mankin和OARSI评分均有明显上升。而在GAA组中，关节软骨的结构保持得相对完整且清晰，OARSI和Mankin评分均呈现明显下降。另外，免疫组化的结果显示，对比DMM组，GAA组的小鼠的软骨细胞中mmp3水平明显下降。<br>　　结论：<br>　　我们的研究结果表明，GAA在体外通过抑制软骨细胞中的内质网应激和NF-κB信号通路来发挥有抗凋亡、抗炎和抗细胞外基质降解的作用。此外，我们的研究结果提示GAA可在体内实验中减轻骨关节炎的进展。这些有希望的结果都表明GAA可能是治疗OA的天然药物。