检索历史 清除

摘要背景：<br>　　慢性炎症是癌症发生的主要危险因素，炎症性肠病（Inflammatory bowel disease，IBD）患者罹患结直肠癌的风险显著增加。探寻炎症相关性结肠癌（Colitis associated colorectal cancer，CAC）的发病机制及干预手段是防治结肠癌的研究重点。当肠道在炎症状态下，口腔微生物可通过消化道及血液循环异位定植到肠道，加剧肠道菌群紊乱、激活下游致癌级联通路，从而促进结肠炎癌转化。前沿研究发现，口腔具核梭杆菌（Fusobacterium nucleatum，Fn）利用特异性表达粘附素A（Fusobacterium adhesin A，FadA）与结肠上皮细胞表面的E-钙黏蛋白（E-cadherin）结合黏附定植结肠上皮细胞，促进肠道菌群紊乱、损害肠上皮屏障，触发下游“Wnt/β-catenin”致癌途径，从而加速 CAC 的发生。<br>　　本研究通过建立Fn感染的炎症相关性结肠癌小鼠模型和“Fn +结肠癌细胞”共培养模型，观察半夏泻心汤的干预效应和作用机制，为防治结肠癌提供新思路。<br>　　方法：<br>　　1 半夏泻心汤对Fn+AOM/DSS炎症相关性结肠癌模型小鼠的干预效应：将C57BL/6 小鼠分为对照（Control）组、具核梭杆菌（Fn）组、炎症相关性结肠癌（AOM/DSS）组、模型（Model）组、半夏泻心汤高剂量（BXD-H）组、半夏泻心汤中剂量（BXD-M）组、半夏泻心汤低剂量（BXD-L）组。除 Control组和AOM/DSS组外，其余各组小鼠每周予以两次Fn菌液灌胃；AOM/DSS组、Model 组和 BXD 组同时采用单次腹腔注射 10 mg/kg 氧化偶氮甲烷（Azoxymethane，AOM）联合 3 个循环 2.5 %葡聚糖硫酸钠（Dextran sulfate sodium salt，DSS）灌胃。BXD-L组、BXD-M组和 BXD-H组从第 2个循环开始，予以不同剂量的半夏泻心汤灌胃，直至实验结束。在实验过程中，观察小鼠的精神状态、体重变化、行动速度、毛发光泽程度、大便质地、是否脱肛等一般情况，同时进行疾病活动指数（Disease activity index，DAI）评分。末次半夏泻心汤灌胃后 24 h，予以眼球采血，颈椎脱臼处死，记录各组结肠组织重量和长度。采用苏木素-伊红（Hematoxylin eosin，HE）染色法检测小鼠结肠组织病理变化；酶联免疫吸附试验（Enzyme-linked immunosorbent Assay，ELISA）检测各组小鼠血清中白细胞介素-4（Interleukin-4，IL-4）、白介素 6（IL-6）、肿瘤坏死因子-α（Tumor necrosis factor，TNF-α） 和干扰素-γ（Interferon-γ， IFN-γ）含量；采用免疫组化检测结肠组织中Ki67表达情况；采用Tunel染色检测细胞凋亡情况。<br>　　2 半夏泻心汤对Fn+AOM/DSS炎症相关性结肠癌模型小鼠肠道菌群和能量代谢的影响：取各组小鼠粪便样本，采用 16S rDNA 检测 Control 组、Fn 组、AOM/DSS组、Model组、BXD-L组、BXD-M组和BXD-H组肠道菌群的变化情况。同时，采用靶向代谢组学，检测各组小鼠血清能量代谢变化；采用微量法检测结肠组织中葡萄糖、D-乳酸含量变化。<br>　　3 半夏泻心阻延 Fn +AOM/DSS 炎症相关性结肠癌模型小鼠 E-cadherin/β-catenin信号通路的影响：采用免疫荧光法检测Control组、Fn组、AOM/DSS组、Model 组、BXD最优剂量组结肠组织中 M2 型巨噬细胞极化情况；采用免疫组化法检测结肠组织中 E-钙粘蛋白（E-cadherin）、β-连环蛋白（β-catenin）表达情况；采用RT-qPCR法检测结肠组织中FadA mRNA水平变化；Western blot法检测结肠组织中无翅型 MMTV 整合位点家族成员 3A（Wingless Type MMTV Integration Site Family, Member 3A，Wnt 3a）、β-catenin、E-cadherin、轴抑制蛋白2（Axis inhibition protein 2, Axin 2）、膜联蛋白A1（Annexin A1）、细胞周期蛋白 D1（Cyclin D1）、糖原合成酶激酶-3β（Glycogen synthase kinase-3β, GSK-3β）蛋白表达情况。<br>　　4 半夏泻心汤抑制 Fn感染的结肠癌细胞恶性行为的效应和机制：制备半夏泻心汤含药血清，将对数生长的 HCT116 和 LoVo 细胞分别分为 6 个组，即Control组、Fn组、E.coli组、Fn+对照血清（Fn+NS）组、Fn+含药血清（Fn + BXD）组、E.coli +含药血清（E.coli + BXD）组。在体外建立 Fn 和HCT116/LoVo 结肠癌细胞共培养模型（感染复数为 100），予以半夏泻心汤含药血清干预。通过细胞增殖实验观察0、24、48和72 h结肠癌细胞增殖情况；检测结肠癌细胞周期变化；通过细胞划痕实验和 Transwell实验检测结肠癌细胞迁移和侵袭能力；Western blot法检测各组E-cadherin、β-catenin、Axin2、Cyclin D1蛋白表达；免疫共沉淀（Co-IP）法检测半夏泻心汤对FadA与E-cadherin结合的影响；粘附实验和侵入实验检测半夏泻心汤对Fn粘附和侵入结肠癌细胞能力的影响。<br>　　结果：<br>　　1 半夏泻心汤对Fn感染的炎症相关性结肠癌的干预疗效：Fn可显著降低小鼠体质量、增加DAI评分，促进结肠肿瘤生长，同时Model组较单纯AOM/DSS组小鼠结肠肿瘤增多，结肠长度明显缩短，而结肠重量显著增加；病理学染色显示 Model 组结肠组织腺瘤样增生明显，炎症浸润和细胞异型性更为显著；Model 组小鼠血清促炎因子水平显著升高，结肠组织中细胞增殖活跃，而肿瘤细胞凋亡降低。予以不同剂量半夏泻心汤干预后，BXD-M组和 BXD-H组小鼠体质量明显增加、DAI 评分显著降低，且结肠肿瘤数量减少、结肠长度增长和结肠重量明显减轻；病理染色显示肿瘤明显减小，炎症浸润和细胞异型性显著减少；BXD-M组和 BXD-H组小鼠血清促炎因子水平明显降低，结肠组织中细胞增殖减少，而肿瘤细胞凋亡增多。<br>　　2 半夏泻心汤对 Fn感染的炎症相关性结肠癌肠道菌群和能量代谢的影响：在Fn联合AOM/DSS构建具核梭杆菌感染的结肠炎癌转化小鼠模型中，具核梭杆菌可以加剧肠道菌群的紊乱：在门水平上，增加拟杆菌门相对丰度，降低水平，降低厚壁菌门/拟杆菌门的比率；在属水平上，降低有益菌乳酸菌属、HT002 菌属、假丝酵母菌属，同时明显增加有害菌 Muribaculaceae unclassified菌属的相对丰度。予以不同剂量的半夏泻心汤治疗，结果显示低剂量组并未对肠道菌群的紊乱表现出明显的改善作用，而中剂量和高剂量组可纠正具核梭杆菌引起的肠道菌群紊乱。在能量代谢方面，Fn 感染的炎症相关性结肠癌小鼠中糖酵解水平更为显著，增加了结肠组织中 D-乳酸含量堆积，而半夏泻心汤可以调复抑制结肠癌组织乳酸水平、抑制糖酵解代谢。<br>　　3 半夏泻心阻延 Fn感染的炎症相关性结肠癌模型小鼠 E-cadherin/β-catenin信号通路的影响：Fn 通过 FadA 可与结肠上皮 E-cadherin 结合，触发 Wnt/β-catenin途径，导致 β-catenin核易位，激活下游致癌信号级，从而促进结肠炎、加速炎症相关性结肠癌形成。予以半夏泻心汤后，可上调 Fn +AOM/DSS 小鼠结肠组织中E-cadherin表达、减少β-catenin表达，并降低FadA mRNA水平，同时增加 E-cadherin、GSK-3β 蛋白含量，减少 Wnt 3a、β-catenin、Axin 2、Annexin A1和Cyclin D1的蛋白含量，从而抑制Wnt/β-catenin信号级联。<br>　　4 半夏泻心汤抑制Fn感染的结肠癌细胞恶性行为的效应和机制：Fn可加速结肠癌HCT116和LoVo细胞增殖，降低细胞G1/G0的比例，同时增加癌细胞侵袭和迁移能力。Fn的毒力因子FadA可与 E-cadherin结合，并激活 β-catenin信号，从而刺激 CRC 细胞的生长。予以半夏泻心汤含药血清后，可减弱 Fn感染引起的癌细胞增殖，增加结肠癌细胞G1/G0的比例，抑制HCT116和LoVo细胞侵袭、迁移能力，同时下调 β-catenin、Axin2和Cyclin D1的蛋白水平。这些改善作用背后的原因是半夏泻心汤含药血清可以抑制FadA与E-cadherin的结合，降低Fn对结肠癌细胞的粘附和侵入能力。<br>　　结论：<br>　　1 半夏泻心汤可阻延Fn感染的炎症相关性结肠癌进展：<br>　　2 半夏泻心汤可调节 Fn感染的炎症相关性结肠癌肠道菌群紊乱和能量代谢；<br>　　3 半夏泻心汤对Fn感染的炎症相关性结肠癌的抑制作用，与其抑制Fn粘附素FadA与E-cadherin结合，调控Wnt/β-catenin信号通路及下游级联事件有关。