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摘要血管性认知功能障碍（VCI）是由脑血管疾病引起的认知功能障碍，症状严重时被称为血管性痴呆（VD）。其特征是由于脑部血管病变导致的认知功能障碍。血管性痴呆的主要病因是脑血管病变，包括脑梗死、脑出血、脑小血管病等。上述血管问题导致脑部特定区域的供血不足，引发神经元损伤继而导致认知功能下降。<br>　　小胶质细胞是存在于中枢神经系统的一种神经胶质细胞，是免疫系统的重要组成部分。小胶质细胞通常呈现为小型、星形状的细胞，具有细长的分枝，其广泛存在于脑组织中，主要分布在神经元的周围。健康状态下，小胶质细胞具有免疫防御，维持神经环境的稳态，参与维持神经元周围的离子、代谢平衡，神经元支持等功能。当中枢神经系统受到损伤、感染或其他异常情况时，小胶质细胞会被激活，发生形态和功能上的变化，参与免疫和炎症反应。颈动脉狭窄是导致血管性痴呆的主要原因，这种状况可导致缺血和缺氧，从而引发神经炎症。因此小胶质细胞在血管性认知功能障碍发病机制中起着关键的作用，其异常激活参与神经炎症的过程，从而导致认知功能损害。<br>　　运动训练可减少炎症介质释放，减少促炎因子产生，增加抗炎因子产生，从而减轻炎症反应。小胶质细胞是神经炎症反应的关键调节细胞，可以释放促炎因子和抗炎因子，调节神经炎症反应。因此，我们假设运动训练通过调控小胶质细胞，减轻炎症反应对脑血管和神经系统的损伤，从而改善血管性认知功能障碍。<br>　　研究目的<br>　　本实验拟通过阻断小鼠的双侧颈总动脉来建立BCCAO模型，通过行为学实验来证明BCCAO会影响小鼠的认知功能；对BCCAO小鼠进行跑台训练，通过行为学实验检测跑台训练对BCCAO小鼠的认知改善情况，并检测小胶质细胞和相关炎症因子是否产生改变，证明小胶质细胞和相关炎症因子的变化介导BCCAO小鼠认知功能的改变。通过分选小胶质细胞以进行转录组测序，来检测小胶质细胞具体的基因改变，证明跑台训练调控了小胶质细胞某些特异性基因的改变来改善血管性认知功能障碍。通过对小胶质细胞特异性基因的筛选和分析，对筛选出的小胶质细胞特异性基因进行干扰，来模拟跑台训练对双侧颈总动脉阻断小鼠小胶质细胞特异性基因的改变，从而进一步证明跑台训练通过改变小胶质细胞特异性基因来改善小鼠的血管性认知功能障碍。<br>　　研究方法<br>　　1.取16只雄性C57BL/6（7-8周龄）小鼠，将小鼠分成Ctrl组（Ctrl）、双侧颈总动脉阻断组（BCCAO），Ctrl组只分离双侧颈总动脉后再缝合，不做任何处理，BCCAO组采用暂时结扎双侧颈总动脉的方法建立血管性认知功能障碍模型，通过激光多普勒检测两组小鼠的脑血流情况。BCCAO后15天，对两组小鼠进行高架十字迷宫和旷场实验，来检测BCCAO小鼠的焦虑情绪和自发活动能力是否受到影响；对两组小鼠进行新物体识别实验和新位置识别实验，来检测BCCAO小鼠是否有认知障碍。<br>　　2.确认BCCAO小鼠有认知障碍后，再次选取18只雄性C57BL/6（7-8周龄）小鼠，用同样的方法进行BCCAO造模，然后将其分为Ctrl组、BCCAO，BCCAO+跑台训练（BCCAO-ex）组，每组各6只，其中BCCAO-ex组在BCCAO5天后进行10天的跑台训练，设置10m/min的速度，每日运动20min。通过激光多普勒检测3组小鼠的脑血流情况。运动结束后第2天对三组小鼠依次进行新物体识别实验，新位置识别实验和水迷宫实验，来检测BCCAO小鼠是否有认知障碍，以及运动是否改善了BCCAO后的认知障碍。行为学测试完毕后，小鼠鼠脑取材，应用实时荧光定量PCR检测三组小鼠海马区炎症因子含量。应用免疫荧光染色检测三组小鼠海马区小胶质细胞的形态和数量。BCCAO和BCCAO-ex组小鼠应用磁珠分选小胶质细胞，然后进行转录组测序，选出基因进行实时荧光定量PCR验证。<br>　　3.经过验证选出差异基因后，制备差异基因小干扰RNA，在细胞上进行干扰效率验证，再次选取18只小鼠，将干扰效率高的小干扰RNA立体定位注射于小鼠海马，将小鼠分为Ctrl（Ctrl），双侧颈总动脉阻断后微量注射对照试剂组（BCCAO-NC-siRNA），双侧颈总动脉阻断后微量注射小干扰RNA组（BCCAO-Spp1-siRNA），每组各6只，BCCAO-NC-siRNA和BCCAO-Spp1-siRNA在造模后5天进行微量注射，10天后，对3组小鼠依次进行高架十字迷宫实验和旷场实验，来检测小鼠的焦虑情绪和自发活动能力是否受到影响。依次采取新物体识别实验，新位置识别实验和水迷宫实验，来检测干扰小胶质细胞特异性基因后对BCCAO小鼠认知障碍的影响。<br>　　结果<br>　　1BCCAO小鼠模型成功建立，且具有记忆障碍。和Ctrl组相比，BCCAO小鼠造模15天检测认知障碍时，新物体识别能力和新位置识别能力下降（p＜0.05）。<br>　　2运动可以改善BCCAO小鼠的记忆障碍，减少BCCAO小鼠的促炎因子，增加抗炎因子的含量，减少BCCAO小鼠的小胶质细胞的数量和激活程度，（p＜0.05）。<br>　　2.1新物体识别和新位置识别测试结果显示，BCCAO小鼠的识别记忆指数低于Ctrl组小鼠，而BCCAO-ex组小鼠识别记忆得到改善，记忆指数高于BCCAO组小鼠（p＜0.05）。<br>　　2.2水迷宫结果显示，训练过程中三组小鼠的潜伏期和平均游泳速度无差别（p＞0.05），测试时，BCCAO小鼠的穿越平台次数显著少于Ctrl组，目标象限停留时间百分比小25%，而BCCAO-ex小鼠穿越平台次数多余BCCAO组小鼠，目标象限停留时间百分比大于25%(p＜0.05)，且与Ctrl组比无差异。<br>　　2.3实时荧光定量PCR结果显示，和Ctrl组小鼠相比，BCCAO组促炎因子（TNF-α、IL-6、IL1-β）含量升高，抗炎因子（IL-4、IL-10）和神经营养因子BDNF含量下降；和BCCAO组相比，BCCAO-ex组促炎因子（TNF-α、IL-6、IL1-β）含量下降，抗炎因子（IL-4、IL-10）含量上升（p＜0.05）。<br>　　2.4免疫荧光组织结果显示，和Ctrl组相比，BCCAO小鼠海马区小胶质细胞数量增加（p＜0.05），形态呈现激活状态；和BCCAO组小鼠相比，BCCAO-ex组小鼠海马区小胶质细胞数量下降（p＜0.05），大部分形态恢复静息状态（p＜0.05）。<br>　　3运动通过调控小胶质细胞特异性基因Spp1改善BCCAO小鼠的血管性记忆障碍。<br>　　3.1经过比较差异基因，发现在BCCAO组和BCCAO-ex组有上调基因779个，下调基因1443个，生物学功能结果显示差异基因最富集于细胞黏附因子，细胞因子受体互作，抗原呈递等通路，筛选出差异表达明显，和研究内容相关的关键基因，如Spp1、Lgals1、Plin2、Cst7、Plxna4、Fabp5。<br>　　3.2转录组测序结果显示Spp1基因与BCCAO小鼠和BCCAO-ex小鼠高度相关，在BCCAO组上升，在BCCAO-ex组下降，并与实时荧光定量PCR验证结果一致（p＜0.05）。<br>　　3.3干扰BCCAO小鼠海马区Spp1基因表达后，将小鼠分为Ctrl（Ctrl），BCCAO微量注射Spp1小干扰RNA组（BCCAO-Spp1-siRNA），BCCAO微量注射对照试剂组（BCCAO-NC-siRNA），新物体和新位置识别实验显示，和Ctrl组相比，BCCAO-NC-siRNA组小鼠记忆指数下降；和BCCAO-NC-siRNA组小鼠相比，BCCAO-Spp1-siRNA组小鼠记忆指数升高（p＜0.05）；水迷宫结果显示：三组小鼠的潜伏期和平均游泳速度无差别（p＞0.05），和Ctrl组小鼠相比，BCCAO-NC-siRNA小鼠的穿越平台次数少于Ctrl组，目标象限停留时间百分比小于25%，和BCCAO-NC-siRNA组小鼠相比，BCCAO-Spp1-siRNA小鼠穿越平台次数多于BCCAO-NC-SIRNA-siRNA组小鼠，且目标象限停留时间百分比大于25%(p＜0.05)。<br>　　结论<br>　　1.BCCAO模型成功建立后小鼠脑组织血流量减少。BCCAO小鼠的认知功能明显受损。<br>　　2.跑台训练显著改善了BCCAO小鼠的认知功能障碍，且跑台训练降低了BCCAO小鼠海马的促炎因子的表达，增加了抗炎因子的表达。跑台训练可能是通过减少小胶质细胞数量，降低小胶质细胞激活，来缓解血管性认知功能障碍的炎症反应，其机制可能与下调海马区小胶质细胞Spp1有关。<br>　　3.通过敲减海马区Spp1表达，进一步证实跑台训练可能通过下调小鼠海马区小胶质细胞Spp1基因表达来改善小鼠的血管性认知功能障碍。<br>　　该研究结果加深了我们对血管性认知功能障碍发病机制的理解，为优化血管性认知功能障碍患者的康复治疗提供了实验依据，这为个体化的血管性认知康复治疗提供了新的研究方向。