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摘要目的：<br>　　研究紫草素（Shikonin，SK）对烟曲霉菌（Aspergillus fumigatus，A. fumigatus）性角膜炎的治疗作用及其机制。<br>　　方法：<br>　　1.通过进行CCK-8实验评估永生化人角膜上皮细胞（HCECs）和小鼠巨噬细胞（RAW 264.7）在不同浓度 SK 处理下的细胞活性，并结合 Draize 眼毒性试验，确定 SK 在体内和体外的安全使用浓度。2.通过使用烟曲霉菌孢子角膜基质注射建立烟曲霉菌角膜炎小鼠模型，实验组小鼠在感染后的1至5天内接受32μM SK溶液或5μg/mL那他霉素的结膜下注射，而对照组则使用0.1%DMSO溶液，观察小鼠角膜的临床表现，记录角膜炎症程度并进行评分。感染 3 天后取小鼠角膜，采用 HE染色法评价 SK对角膜中炎症细胞浸润的影响；利用 RT-PCR技术检测小鼠角膜中IL-1β、TNF-α和IL-6的mRNA表达水平，并通过Western blot法和免疫荧光法检测自噬相关蛋白 LC3BⅡ、Beclin-1 和 P62 的表达情况。3.使用 2μM SK 溶液或 0.1%DMSO 溶液预处理RAW 264.7细胞2小时，随后加入灭活的烟曲霉菌菌丝刺激细胞。使用 RT-PCR 法检测 RAW 264.7 细胞中炎症因子 IL-1β、IL-6 和 TNF-α 的mRNA 表达；使用 Western blot 法检测 RAW 264.7中 LC3BⅡ、Beclin-1和 P62的蛋白表达；采用透射电子显微镜(TEM)研究 SK 对 RAW 264.7 细胞自噬的影响。4.使用 50μg/mL 3-甲基腺嘌呤（3-MA）预处理 RAW 264.7细胞 1小时，随后使用 2μM SK溶液或 0.1%DMSO 溶液处理 RAW 264.7细胞 2 小时，之后加入灭活的烟曲霉菌菌丝刺激细胞。使用 Western blot 法检测 RAW 264.7中 Beclin-1的蛋白表达；使用ELISA法检测 RAW 264.7细胞中炎症因子 IL-1β、IL-6、TNF-α的 mRNA 表达。5.分别使用 2μM SK溶液或 0.1%DMSO 溶液处理 RAW 264.7细胞，加入同等量烟曲霉菌孢子，在0小时或2小时取等量上述悬液分别培养，24小时后计算吞噬指数，评估 SK 对 RAW 264.7 细胞吞噬能力的影响。6. 采用最低抑菌浓度实验、钙氟白（CFW）荧光染色法以及过碘化丙啶（PI）摄取法，测定 SK 对真菌生长的抑制作用。同时，制备烟曲霉菌生物膜，并使用不同浓度的 SK（1, 2, 4, 8, 16, 32, 64μM）处理真菌成熟期的生物膜 24 小时，通过结晶紫染色法测定真菌生物膜的破坏情况。此外，利用HE染色法观察SK对烟曲霉菌孢子对HCECs表面的黏附情况。<br>　　结果：<br>　　1.SK浓度为0-32 μM时对小鼠角膜没有毒性，SK浓度为0-2μM时对RAW 264.7细胞和HCECs细胞没有毒性，后续实验中，体外实验使用 2μM SK，体内实验使用32 μM SK。<br>　　2.在小鼠烟曲霉菌性角膜炎模型中，与0.1%DMSO组相比，32 μM SK预处理组临床评分显著降低，角膜中的炎症细胞浸润数量明显减少。RT-PCR结果表明SK组感染角膜中的炎症因子IL-1β、TNF-α及IL-6的mRNA表达减少，Western blot实验和免疫荧光实验结果表明，SK预处理组感染角膜中的 LC3BⅡ和 Beclin-1的表达增加，P62的表达减少。<br>　　3.在烟曲霉菌刺激的 RAW 264.7细胞中，RT-PCR结果表明 2μM SK预处理显著降低了炎症因子IL-1β、IL-6和 TNF-α的 mRNA表达，Western blot实验表明 SK预处理上调了LC3BⅡ和Beclin-1蛋白表达，下调了P62的蛋白表达，ELISA结果表明3-MA预处理减弱了SK对Beclin-1蛋白的上调和对炎症因子IL-1β、IL-6和TNF-α蛋白的下调，TEM结果显示 SK处理增加了RAW 264.7细胞中自噬溶酶体数量、吞噬真菌数量和线粒体嵴数量。烟曲霉菌孢子吞噬实验表明SK组相较0.1%DMSO组，烟曲霉菌分生孢子的吞噬能力增强。<br>　　4. 经过 SK 与烟曲霉菌孢子共培养 36 小时的实验，观察到从 4μM 浓度开始， SK即对烟曲霉菌的生长产生了明显的抑制作用，并且这种抑制作用随着SK浓度的升高而逐渐增强。使用不同浓度的 SK（4, 8, 16, 32, 64μM）处理成熟期的真菌生物膜，经过 24 小时的处理后，发现真菌生物膜的量相比对照组明显减少。与对照组相比，使用2μM的SK处理后，烟曲霉菌孢子在HCECs表面的黏附数量显著减少。而当使用SK（8, 16, 32, 64μM）处理时，真菌细胞膜完整性被破坏且破坏程度呈浓度依赖性递增。<br>　　结论：<br>　　在烟曲霉菌性角膜炎的治疗中，SK 通过激活自噬展现出了显著的抗炎和角膜保护效应。同时，SK 还具备抑制烟曲霉菌菌丝生长、抑制真菌孢子在细胞表面的黏附以及破坏生物膜的能力，从而展现出对烟曲霉菌的强效抑菌活性。