检索历史 清除

摘要研究目的<br>　　本研究拟通过观察鞘氨醇激酶1（Sphingosinekinase1,SPHK1）在脓毒症相关急性肾损伤（Sepsis-associatedacutekidneyinjury,SA-AKI）中的表达情况，并进一步探究SPHK1是否参与线粒体功能障碍诱导的肾小管上皮细胞（Renaltubularepithelialcells,RTECs）焦亡信号通路激活，以明确其对SA-AKI的调控作用及具体分子机制，为研发新的SA-AKI生物标志物与分子靶向治疗提供实验依据。<br>　　研究方法<br>　　C57BL/6J小鼠经盲肠结扎穿孔（Cecalligationandpuncture,CLP）诱导体内SA-AKI模型，假手术组（Sham）于相同实验条件下仅进行开腹操作，不进行CLP处理；收集肾脏组织与血液标本，通过检测血清肌酐（Creatinine,Cr）和尿素氮（Bloodureanitrogen,BUN）水平、肾脏组织Hamp;E染色，评估肾组织损伤严重程度；通过qRT-PCR实验检测肾组织SPHK1、肾损伤分子（Kidneyinjurymolecule-1,KIM-1）及炎症因子的mRNA表达水平；通过WesternBlot实验、免疫组织化学染色实验及组织免疫荧光染色实验检测肾组织SPHK1、KIM-1蛋白表达水平及定位。脂多糖（Lipopolysaccharide,LPS）刺激HK-2细胞诱导体外SA-AKI模型，检测细胞培养基中乳酸脱氢酶（Lacticdehydrogenase,LDH）水平，评估体外细胞损伤程度；通过qRT-PCR实验、WesternBlot实验检测HK-2细胞中SPHK1和KIM-1表达水平。综合以上体内体外实验结果，初步评价SA-AKI模型中，SPHK1与肾损伤相关分子表达的相关性。<br>　　随后使用C57BL/6J背景下的野生型小鼠和SPHK1基因敲除小鼠，并经Sham/CLP处理，检测肾损伤指标及相关分子的表达情况；结合体外实验使用si-NC、si-SPHK1转染HK-2细胞并经PBS/LPS刺激后，检测LDH及相关分子的表达情况。综合以上体内体外实验结果，进一步评价SPHK1对SA-AKI发生发展的调控作用。<br>　　使用si-NC、si-SPHK1转染HK-2细胞并经PBS/LPS刺激，通过WesternBlot实验检测标志细胞焦亡相关蛋白的表达水平，评估SPHK1对LPS引起的HK-2细胞焦亡的影响；并进一步检测NLRP3等多种炎症小体的表达水平，探究SPHK1介导细胞焦亡的具体炎症小体通路；随后通过细胞电镜检测细胞线粒体损伤情况；通过MitoSOX?线粒体超氧化物指示剂检测活性氧（Reactiveoxygenspecies,ROS）情况；为明确在SA-AKI中，SPHK1通过调控线粒体ROS以激活NLRP3信号通路，进一步在沉默SPHK1的HK-2细胞中使用线粒体ROS激活剂/抑制剂预处理，再经LPS处理后通过WesternBlot实验验证该调控机制。通过细胞免疫荧光染色实验检测线粒体DNA（Mitochondrial,mtDNA）向胞质的转移，以探究SA-AKI中SPHK1是否参与调控线粒体损伤和线粒体ROS及其介导的mtDNA的渗漏；并进一步通过qRT-PCR实验、WesternBlot实验检测过氧化物酶体增殖物激活受体γ辅助活化因子1α（Peroxisomeproliferator-activatedreceptor-gammacoactivator1alpha,PGC-1α）和线粒体转录因子（MitochondrialtranscriptionfactorA,TFAM）的表达，以探究SPHK1对于线粒体生物发生功能的调控作用。为明确在SA-AKI中，SPHK1通过调控PGC-1α表达以激活NLRP3信号通路，在沉默SPHK1的HK-2细胞中进一步沉默PGC-1α或使用PGC-1α激活剂/抑制剂预处理，再经LPS处理后通过WesternBlot实验验证该调控机制。通过以上体外实验结果，揭示SPHK1通过线粒体功能障碍诱导肾小管上皮细胞SA-AKI发生发展的调控作用。<br>　　为明确SPHK1抑制剂（PF-543）的治疗效果，首先使用HK-2细胞进行体内验证。HK-2细胞经PF-543预处理后接受LPS刺激，先后通过LDH试剂盒检测培养基中LDH释放水平、细胞电镜检测线粒体损伤、MitoSOX?线粒体超氧化物指示剂检测线粒体ROS情况、细胞免疫荧光染色实验检测mtDNA渗漏、WesternBlot实验检测本研究涉及相关蛋白的表达、ELISA试剂盒检测培养基中白细胞介素-1β（Interleukin-1β,IL-1β）和白细胞介素-18（Interleukin-18,IL-18）水平。并结合体内实验，使用C57BL/6J野生型小鼠进行验证，经PF-543预处理后接受CLP刺激，并先后通过试剂盒检测血清Cr/BUN水平、Hamp;E染色和免疫组织化学实验检测肾损伤情况、WesternBlot实验检测本研究涉及相关蛋白的表达。通过上述体外及体内实验结果，观察抑制SPHK1活性对SA-AKI的治疗作用，进一步证实SPHK1在SA-AKI病情进展中的关键调控作用。<br>　　研究结果<br>　　SPHK1在SA-AKI中表达升高，且与线粒体功能障碍诱导的细胞焦亡通路相关。动物及细胞实验模型证实：在SA-AKI中，SPHK1表达上调通过抑制PGC-1α表达，激活线粒体损伤诱导的NLRP3相关焦亡信号通路，最终导致RTECs损伤。机制研究表明，在SA-AKI中。SPHK1表达上调抑制PGC-1α的表达，以促进线粒体损伤及线粒体ROS诱导的NLRP3相关焦亡信号通路的激活。线粒体ROS抑制剂预处理可缓解SPHK1表达上调引起的NLRP3焦亡通路激活，而线粒体ROS激活剂预处理可回复SPHK1低表达引起的NLRP3焦亡通路激活抑制。PGC-1α激活剂预处理可缓解SPHK1表达上调引起的NLRP3焦亡通路激活，而沉默PGC-1α或PGC-1α抑制剂预处理可回复SPHK1低表达引起的NLRP3焦亡通路激活抑制。<br>　　研究结论<br>　　SPHK1在SA-AKI中表达上调，并通过抑制PGC-1α的表达引起线粒体功能障碍以促进mtDNA渗漏，从而激活NLRP3信号通路及其介导的细胞焦亡，最终诱导RTECs损伤。PF-543可在体内/体外缓解SA-AKI。