检索历史 清除

摘要目的：本研究旨在明确类风湿关节炎（RA）滑膜炎症持续化和成纤维样滑膜细胞（FLS）炎性基因持续表达的原因和机制。然后从组蛋白乙酰化修饰角度，进一步探讨雷公藤甲素（TP）通过调控组蛋白3第27位赖氨酸（H3K27）乙酰化，阻断RA-FLS炎症基因持续表达，恢复RA滑膜炎症的“刹车”的机制。最后探究TP调控组蛋白H3K27乙酰化的蛋白靶点。<br>　　方法：1.构建胶原诱导型关节炎（CIA）大鼠模型，对滑膜进行 RNA-seq 测序检测CIA大鼠滑膜炎症持续情况，然后通过滑膜H＆E染色和免疫组化进一步验证。通过番红固绿染色和抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）染色观察大鼠关节骨质进行性破坏情况。通过实时荧光定量聚合酶链式反应（RT-qPCR）、酶联免疫吸附反应（ELISA）、蛋白质免疫印迹（Western blot）、免疫荧光（IF）等技术检测 TNF-α 诱导FLS及巨噬细胞（M?）中炎症因子TNF-α、IL-1β、IL-6的表达情况。并进一步通过Western blot、IF等技术检测FLS中核因子κB（NF-κB）的表达和组蛋白H3K27乙酰化的情况。<br>　　2.体内实验使用9.31μg/(kg*d)和18.62μg/(kg*d)剂量的TP干预CIA大鼠模型，通过试剂盒和H＆E染色检测TP对CIA大鼠肝肾功能和生殖毒性的影响；番红固绿染色和TRAP染色检测TP对关节骨质破坏情况；RNA-seq测序、ELISA、免疫组化检测 TP 对滑膜炎症的影响；Western blot 检测 TP 对滑膜组蛋白 H3K27 乙酰化的影响。体外实验通过细胞增殖与毒性检测实验（CCK8）检测TP对FLS增殖活性的影响；流式检测TP对FLS凋亡的影响；细胞迁移实验和侵袭实验检测TP对FLS的迁移和侵袭的影响；Western blot检测 TP对 FLS中炎症因子 TNF-α、IL-1β、IL-6及转录因子 NF-κB表达和 H3K27乙酰化的影响。联合多种高通量测序技术（RNA-seq + CUT＆Tag + ATAC-seq）检测TP对FLS中炎症相关基因位点H3K27乙酰化及染色质可及性的影响。<br>　　3.通过反向分子对接分析 TP 与组蛋白乙酰化酶（HAT）和组蛋白去乙酰化酶（HDAC）之间的结合能力，并根据自由结合能的高低筛选出结合能较低的蛋白靶点进行验证。Western blot 和免疫荧光检测 TNF-α 干预不同时间点 FLS 和 M? 中组蛋白乙酰化酶 p300 和组蛋白去乙酰化酶 HDAC3/6/7/8 的表达情况。Western blot 和免疫荧光检测TP干预对FLS和CIA大鼠滑膜中p300表达的影响。使用组蛋白乙酰化酶p300竞争性抑制剂 A485去抑制 p300表达，和组蛋白去乙酰化酶抑制剂 TSA去促进p300表达，观察TP对FLS中p300表达以及组蛋白H3K27乙酰化的影响。生物素标记TP，采用Pull-down的方法将TP作用的蛋白靶点筛选并富集，然后进行质谱分析和 Western blot检测，明确 TP作用的蛋白靶点。<br>　　结果：1.胶原诱导大鼠关节炎后，大鼠肺组织和滑膜都出现炎症细胞浸润，并且肺组织炎症一个月内会消失，而滑膜炎症则持续存在。CIA 大鼠血清和滑膜中炎症因子TNF-α表达持续升高，滑膜炎症相关基因持续表达。并且CIA大鼠关节软骨和骨组织随着造模时间延长出现进行性破坏。与M?相比，FLS和其细胞系MH7A炎症基因随TNF-α干预时间延长持续表达，炎症因子TNF-α、IL-1β、IL-6表达增加。FLS中转录因子 NF-κB表达和组蛋白 H3K27乙酰化水平与 FLS炎症基因表达趋势一致。<br>　　2. 9.31μg/(kg*d)和 18.62μg/(kg*d)的 TP对 CIA大鼠血清中谷丙转氨酶、谷草转氨酶、尿素氮、肌酐及睾丸组织中的酸性磷酸酶表达没有明显影响。TP可以明显缓解大鼠关节肿胀，改善关节炎评分，效果不弱于甲氨蝶呤（1.05 mg/(kg*w)）。TP可以缓解关节软骨和骨组织的进行性破坏，抑制滑膜炎症因子 TNF-α和转录因子 NF-κB的表达，抑制滑膜炎症基因和基质金属蛋白酶基因的转录。TP可以抑制 FLS的增殖，且呈现出时间依赖性和浓度依赖性。20 nM 和 40 nM 的 TP 可以抑制 FLS 炎症相关侵袭性表型，如凋亡、迁移、侵袭等。TP可以抑制FLS中炎症因子TNF-α、IL-1β、IL-6及转录因子NF-κB的表达，降低FLS中总的H3K27乙酰化水平。TP可以降低FLS中炎症基因（如TNFSF15、TNFRSF18、NFKB）位点的H3K27乙酰化水平和染色质可及性。<br>　　3.反向分子对接证实 TP 与 p300、HDAC3/6/7/8 亲和力较高。FLS 中 p300 随TNF-α干预时间延长表达增加，与炎症因子表达趋势一致。而HDAC3/6/7/8随TNF-α干预时间延长表达变化不明显。体外实验证实TP可以抑制FLS中p300的表达。体内实验证实TP可以抑制CIA大鼠滑膜中p300的表达。使用A485和TSA联合干预，证实TP可能通过抑制FLS中的p300的表达从而降低组蛋白 H3K27乙酰化水平。Pull-down实验证实转录因子NF-κB和p300可能是TP潜在作用的蛋白靶点。<br>　　结论：FLS中炎症基因持续表达可能是 CIA大鼠滑膜存在持续性滑膜炎和关节软骨及骨组织进行性破坏的关键因素。组蛋白H3K27高度乙酰化是FLS炎症基因持续表达的重要机制。TP可以通过下调FLS中炎症基因处的组蛋白 H3K27乙酰化水平，降低染色质可及性，抑制转录因子如NF-κB与炎症基因结合，从而阻断FLS炎症基因持续表达，恢复 FLS 中炎症“刹车”机制，最终抑制持续性滑膜炎症。而p300可能是TP下调FLS中组蛋白H3K27乙酰化水平的直接作用靶点。