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摘要随着抗生素的广泛使用，兽医临床中常见致病菌产生了抗生素耐受性，抗生素耐受性是指细菌能够在远高于治疗浓度的药物存在下持续生存的能力。耐受性细菌的出现严重影响了现有抗生素对细菌性疾病的治疗效果，为了确保抗生素的有效使用，以应对细菌性疾病的持续威胁，我国农业农村部相继出台一系列替抗减抗的政策，一种新型的替抗产品——酸化剂，被广泛应用于畜禽养殖生产过程中。然而酸化剂，尤其是有机酸化剂，因其具有与某些抗生素相同的杀菌机制，是否会同抗生素一样诱导耐受性细菌的产生，引起了研究人员的高度关注。基于此，本研究以兽医临床常用酸化剂柠檬酸和大肠杆菌为研究对象，探讨酸化剂在体内和体外对大肠杆菌耐受性的影响，阐述其诱导产生耐受性的分子机制，进而筛选可在一定程度上抑制酸化剂产生耐受性细菌的潜在抑制剂前体，恢复抗生素的杀菌能力，逆转细菌的抗生素耐受性表型，为酸化剂在兽医临床的合理使用提供理论支持。主要试验结果如下：<br>　　1.柠檬酸诱导大肠杆菌产生抗生素耐受性<br>　　模拟兽医临床使用酸化剂（磷酸、乳酸、柠檬酸和延胡索酸）的条件，探究酸化剂的使用对E.coli和S.aureus的影响；通过小鼠大肠杆菌感染模型观察柠檬酸的使用对体内抗生素治疗效果的影响；使用柠檬酸诱导E.coliO157:H7和E.coliB2筛选耐受性菌株。结果显示，在E.coli和S.aureus生长过程中添加酸化剂，可降低细菌的生长速率，诱导了耐受性细菌产生；小鼠大肠杆菌感染模型表明柠檬酸的使用可降低环丙沙星的治疗效果；柠檬酸体外连续诱导筛选的耐受性大肠杆菌生长速率降低，抗生素对其杀菌活力降低，耐受性形成频率增加，且耐受性大肠杆菌相较于野生型大肠杆菌更易产生耐药性。<br>　　2.柠檬酸诱导大肠杆菌耐受性产生机制初探<br>　　本研究对野生型大肠杆菌和上述研究得到的耐受性大肠杆菌进行转录组学测序和非靶向代谢组检测；使用qRT-PCR对筛选得到的20个差异表达基因进行表达量验证，对耐受性大肠杆菌产生的机制进行初步探究；基于KEGG通路对差异表达基因进行联合分析，筛选可能影响大肠杆菌耐受性产生的差异基因和代谢物。结果表明，耐受性菌株CA-E.coliO157:H7相较于野生型菌株E.coliO157:H7，在转录水平上共有1202个差异表达基因，其中985个基因表达量显著下调，217个基因表达量显著上调，非靶向代谢组筛选获得603个差异表达代谢物。耐受性菌株CA-E.coliB2相较于野生型菌株E.coliB2，在转录水平上共有1308个差异表达基因，其中462个基因表达量显著下调，846个基因表达量显著上调，非靶向代谢组筛选获得815个差异表达代谢物。差异表达基因验证结果推测耐受性细菌产生机制可能与细胞呼吸、能量代谢、嘌呤代谢和细胞膜组分有关。转录组学测序联合非靶向代谢组分析显示，差异表达基因和差异代谢物在细胞呼吸、TCA循环、氧化应激和嘌呤代谢等通路被显著富集。<br>　　3.柠檬酸诱导大肠杆菌产生耐受性机制分析<br>　　分别对野生型大肠杆菌和上述研究得到的耐受性大肠杆菌膜相关指标（细胞膜通透性、细胞膜完整性、细胞膜电位改变、生物被膜形成能力及多药外排泵能力）和参与代谢过程相关指标（细胞呼吸水平、胞内ATP水平、NAD+/NADH水平、胞内ROS含量和胞内T-SOD水平）进行检测；对可能参与耐受性产生的差异表达基因，基于λ-Red重组系统，对E.coliO157:H7菌株表达量显著下调的基因（sad、galT、guaD、cpbB）进行敲除株及回补株的构建，同时使用pBBR工程质粒对E.coliO157:H7菌株表达量显著上调的基因（yahI和gabD）进行过表达菌株的构建，通过测定环丙沙星对敲除株、回补株和过表达株的杀菌活力，验证差异基因在形成耐受性大肠杆菌中发挥的作用。结果表明，耐受性大肠杆菌相较于野生型大肠杆菌，细胞膜完整性、细胞膜通透性及生物被膜形成能力无显著差异，但细胞膜电位发生改变；添加多药外排泵抑制剂可恢复环丙沙星对耐受性大肠杆菌的杀菌活力；耐受性大肠杆菌细胞呼吸水平降低，ATP生成减少，氧化-抗氧化系统失衡；成功筛选得到了影响细菌耐受性产生的关键基因guaD和gabD。<br>　　4.琥珀酸和黄嘌呤逆转大肠杆菌耐受性并调节雏鸡肠道菌群<br>　　最后验证关键基因guaD和gabD的代谢物琥珀酸和黄嘌呤在大肠杆菌耐受性产生中的关键作用。首先在环丙沙星杀伤耐受细菌过程中加入差异代谢物琥珀酸和黄嘌呤，验证添加琥珀酸和黄嘌呤协同环丙沙星对耐受性大肠杆菌的杀伤作用；随后在环丙沙星治疗大蜡螟感染模型和小鼠急性感染模型过程中琥珀酸和黄嘌呤，观察琥珀酸和黄嘌呤对环丙沙星治疗耐受性大肠杆菌感染的治疗效果；通过模拟酸化剂在临床中的使用情况，添加黄嘌呤和琥珀酸作为酸化剂增效剂，观察琥珀酸和黄嘌呤联合酸化剂使用后对雏鸡肠道菌群的调节作用。结果显示，琥珀酸和黄嘌呤的使用，可恢复环丙沙星对耐受性大肠杆菌的杀菌活力；提高环丙沙星对大蜡螟大肠杆菌感染模型和小鼠大肠杆菌感染模型的治疗效果；在酸化剂的使用过程中添加黄嘌呤和琥珀酸，可提高雏鸡肠道菌群生物多样性，降低肠道中条件性致病菌（嗜血杆菌）的产生，增加耐酸性益生菌的含量，提高肠道菌群的代谢活力。<br>　　综上所述，本研究通过体内和体外试验研究柠檬酸对大肠杆菌耐受性的影响，发现酸化剂的不合理使用会诱导大肠杆菌抗生素耐受性的产生。研究确定了柠檬酸诱导大肠杆菌产生耐受性的机制与细菌细胞呼吸、氧化应激和嘌呤代谢等途径有关；筛选到影响细菌耐受性的关键基因guaD和gabD，并确证了代谢物琥珀酸和黄嘌呤可有效逆转柠檬酸诱导产生的大肠杆菌耐受性；进一步研究发现琥珀酸和黄嘌呤的使用可调节雏鸡肠道菌群。研究结果为阐明柠檬酸诱导大肠杆菌耐受性产生机制研究及研发新型耐受抑制剂的研发奠定了基础。