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摘要背景：肺癌是目前世界上发病率和死亡率位居第一的癌症，其中非小细胞肺癌(NSCLC)患者约占所有肺癌患者的85%。针对晚期或转移性的非小细胞肺癌患者，多采用小分子靶向抑制剂联合放、化疗方案进行治疗。克唑替尼是一种针对发生EML4-ALK融合、ROS1重排的NSCLC患者的多靶点小分子靶向抑制剂，同时对MET第14外显子的缺失的NSCLC患者也有显著的治疗效果。NF1作为调控Ras活性的抑癌因子，它的功能缺失常常导致RAS/MAPK和PI3K/AKT信号通路的激活，促进细胞恶性增殖。根据大量的研究发现，目前已知的克唑替尼耐药机制包括MET扩增、MET第14外显子剪切位点突变、KRAS扩增、KRASG12D突变及活性的改变等，但仍有25%的患者耐药机制不明确。因此，阐明MET抑制剂耐药的机制及制定针对耐药患者有效的治疗方案具有十分重要的意义。<br>　　方法：在这项研究中，我们首先利用CRISPR-Cas9技术，成功的构建了NF1敲除细胞模型；然后，我们使用野生型和NF1缺失型细胞模型对包含606种小分子抑制剂的药物文库进行筛选，通过计算每种药物对野生型和NF1缺失型细胞的生长抑制率，筛选出对NF1缺失型细胞敏感和NF1缺失型细胞耐受的药物；接下来，我么围绕筛选的饿到的药物及靶点，开展体外实验验证细胞模型的耐药表型和对NF1缺失型细胞敏感的药物；通过分子生物学方法探究耐药的分子机制及敏感型药物对NF1缺失型细胞特异性抑制的作用机制。<br>　　结果：首先，Westernblotting结果证明采用CRISPR-Cas9技术成功构建了NF1野生和敲除的同源Hela、PC-9与NCI-H1299细胞系；细胞增殖和克隆形成实验结果显示，NF1缺失型细胞的增殖速率和克隆形成能力显著高于野生型细胞。下一步通过小分子靶向药物文库筛选鉴定了NF1缺失型细胞对三种MET抑制剂(PF-04217903、Tepotinib、PHA-665752)表现出不同程度的耐受；而在NF1缺失型细胞敏感型药物中，Go6983(一种PKC多靶点抑制剂)表现出对NF1缺失型细胞特异性的抑制作用。接下来的体外实验中，细胞抗增殖实验及集落形成实验的结果表明，NF1缺失型细胞对MET抑制剂的IC50值显著高于野生型细胞；相同浓度药物处理后，NF1缺失型细胞的抑制率显著低于野生型细胞；细胞凋亡结果可以看出，相同浓度的克唑替尼处理48小时后，NF1缺失型细胞经克唑替尼诱导的细胞凋亡比例显著低于野生型细胞。进一步的分子机制研究发现，NF1缺失型细胞中RAS-GTP的表达显著上调，导致下游信号通路中PI3K/AKT通路被激活，表现为p-AKT表达上调；检测凋亡相关蛋白发现，抗凋亡蛋白MCL-1在NF1缺失型细胞中高表达，与克唑替尼诱导的细胞凋亡结果高度一致。<br>　　另一方面，我们对NF1缺失型细胞敏感的药物Go6983进行体外功能验证发现，相同浓度的Go6983处理后，NF1缺失型细胞的细胞活力和生长速率显著被抑制，这种特异性抑制作用是由于NF1缺失型细胞中依赖于PKCα上调介导的细胞周期进展；细胞周期检测结果发现，敲降PKCα后，NF1缺失型细胞的生长被抑制，S期细胞减少、G0/G1期细胞增多，表现为G1期细胞周期阻滞。同时，抑制PKCα会导致细胞内ROS的表达上调，诱导细胞损伤并发生细胞衰老。<br>　　结论：我们的研究结果表明，NF1缺失导致NSCLC细胞对MET抑制剂的耐药，其主要机制是NF1缺失激活RAS/PI3K/AKT信号通路，诱导抗凋亡蛋白MCL-1的表达产生抗凋亡效应，从而表现出MET抑制剂的耐药；另一方面，Go6983通过抑制NF1缺失型细胞中高表达的PKCα，下调p-RB表达并诱导细胞发生G1期阻滞和细胞衰老。