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摘要砷是一种公认的有毒物质和致癌物,长期暴露砷可对人类健康造成严重威胁,导致消化、心血管、生殖等系统疾病以及皮肤癌、肝癌和肺癌等肿瘤.肝脏是砷代谢和储存的主要器官,砷在肝脏的积累会导致不同程度的肝损伤和多种肝脏疾病.肝纤维化是一种修复性或反应性过程,肝星状细胞(HSCs)的激活是其关键步骤.炎症因子的释放、自由基的产生和DNA损伤等不良事件的启动促使静止的HSCs向肌成纤维细胞转化,分泌的I型和Ⅲ型胶原蛋白等细胞外基质(ECM)在肝脏过度沉积从而导致肝纤维化.砷可通过炎症反应和氧化应激等途径引起HSCs激活,但其诱导肝纤维化的分子机制尚未完全阐明.<br>　　长链非编码RNA(lncRNA)作为微小RNA(miRNA)的竞争性内源RNA(ceRNA)受到了广泛关注.lncRNAs可通过隔离结合的miRNAs的活性,有效抑制该miRNA与其靶基因结合,进而直接激活HSCs中的信号通路诱导其活化或调控除HSCs外的细胞产生促纤维化因子间接激活HSCs,从而参与肝纤维化的发生发展.辅助性T细胞17(Th17细胞)是由T细胞分化而来的一种Th细胞亚群,可分泌IL-17A、IL-17F、IL-22和IL-23等细胞因子刺激炎症过程,通过参与适应性免疫炎症反应调控肝纤维化的进展.最新证据发现,lncRNAs作为ceRNAs参与调节T细胞分化,在自身免疫性疾病、癌症、炎症性疾病中发挥重要作用.然而,lncRNAs和Th17细胞及lncRNAs如何调控T细胞Th17分化在砷所致HSCs激活和肝纤维化中发挥作用需要进一步研究.<br>　　因此,本研究通过构建砷所致小鼠肝纤维化的体内模型和砷处理的T细胞体外细胞模型,深入研究lncRNAHOTAIR介导T细胞Th17分化在砷所致HSCs激活和肝纤维化中的作用和具体分子机制,为砷所致肝脏疾病的防治提供新思路和新线索.<br>　　目的<br>　　探讨lncRNAHOTAIR通过miR-17-5p调控T细胞Th17分化在砷所致肝纤维化中的作用及分子机制.<br>　　方法<br>　　首先构建不同剂量亚砷酸钠(NaAsO2)慢性暴露小鼠模型和四氯化碳(CCl4)所致肝纤维化小鼠模型.将6~8周雄性C57BL/6小鼠随机分为对照组、低砷暴露组(10ppmNaAsO2)、高砷暴露组(20ppmNaAsO2)和CCl4组,每组10只.对照组小鼠给予灭菌纯净水,低砷暴露组和高砷暴露组小鼠分别给予含有相应剂量NaAsO2的灭菌纯净水处理12个月.CCl4组小鼠腹腔注射0.4mL/kg.BWCCl4,每周2次,共6周.苏木精-伊红(Hamp;E)和Masson染色观察肝损伤和纤维化发生情况;免疫组织化学(IHC)染色观察α-SMA、COL1A2和CD4表达情况;免疫荧光(IF)染色观察RORγt和IL-17A表达情况;Westernblots检测α-SMA、COL1A2、RORγt和IL-17A蛋白水平;ELISA检测IL-17分泌水平;qRT-PCR检测lncRNAsMALAT1、H19、lincRNA-p21、MEG3和HOTAIR水平.<br>　　其次,利用不同剂量(0、2、4和8μM)NaAsO2处理Jurkat细胞48h,流式细胞术检测Th17细胞比例;Westernblots检测RORγt和IL-17A蛋白水平;ELISA检测IL-17分泌水平;qRT-PCR检测HOTAIR、miR-3666、miR-17-5p、miR-148a-3p、miR-519d-3p、miR-93-5p和miR-20b-5p水平;双荧光素酶报告基因实验验证HOTAIR和miR-17-5p调控关系.接下来将不同剂量NaAsO2处理的Jurkat细胞培养上清液处理LX-2细胞24h,Westernblots检测α-SMA和COL1A2蛋白水平;IF染色观察细胞形态和α-SMA表达情况;胶原皱缩实验观察胶原凝胶收缩情况.进一步转染HOTAIRsiRNA或miR-17-5pmimic或联合转染HOTAIRsiRNA和miR-17-5pinhibitor,分别研究HOTAIR和miR-17-5p及HOTAIR调控miR-17-5p在砷诱导的T细胞Th17分化和HSCs激活中的作用.<br>　　最后,应用腺相关病毒(AAV)干扰小鼠肝脏HOTAIR表达或无基因组表达的空AAV作为阴性对照构建慢性砷暴露所致小鼠肝纤维化模型.将6~8周雄性C57BL/6小鼠随机分为对照组、高砷暴露组(20ppmNaAsO2)、高砷暴露联合HOTAIR干预组(20ppmNaAsO2+AAV-shHOTAIR)和高砷暴露联合AAV对照组(20ppmNaAsO2+AAV-shNC),每组6只.HOTAIR干预组小鼠暴露于20ppmNaAsO29个月后通过尾静脉注射100μL含有2×1011vgAVV9载体基因组病毒量的无菌盐水,再继续暴露3个月.AAV-shNC组小鼠同样注射相同体积和病毒量的空AAV.Hamp;E和Masson染色观察肝损伤和纤维化发生情况;IHC染色观察α-SMA、COL1A2和CD4表达情况;IF染色观察RORγt和IL-17A表达情况;Westernblots检测α-SMA、COL1A2、RORγt和IL-17A蛋白水平;ELISA检测IL-17分泌水平;qRT-PCR检测HOTAIR和miR-17-5p水平.<br>　　结果<br>　　一、慢性暴露NaAsO2对小鼠肝损伤、纤维化及肝组织CD4+T细胞浸润、Th17细胞和HOTAIR表达的影响<br>　　结果发现,与对照组相比,NaAsO2和CCl4慢性处理引起小鼠肝组织结构改变和肝细胞变性广泛;肝组织出现广泛的胶原蛋白沉积;纤维化标志物α-SMA和COL1A2表达增多;炎细胞浸润,其中CD4+T细胞表达增多;Th17细胞分化关键转录因子RORγt和Th17相关细胞因子IL-17A表达增多,并主要分布在门管区,与胶原蛋白沉积位置类似;α-SMA、COL1A2、RORγt和IL-17A蛋白水平升高;血清IL-17分泌增多;lncRNAsMALAT1、H19和HOTAIR的表达增加,以HOTAIR的升高最为显著.说明慢性暴露NaAsO2可引起小鼠肝损伤和纤维化,Th17细胞和HOTAIR可能参与NaAsO2所致肝纤维化过程.<br>　　二、NaAsO2对T细胞Th17分化、HOTAIR和miR-17-5p水平的影响<br>　　结果发现,NaAsO2引起Jurkat细胞中Th17细胞比例升高呈剂量依赖性;RORγt和IL-17A蛋白水平升高;培养上清液IL-17分泌增多;HOTAIR表达水平升高而miR-17-5p表达水平降低;HOTAIR和miR-17-5p存在结合位点,且HOTAIR负向调控miR-17-5p.说明NaAsO2促进T细胞Th17分化,并且引起细胞内HOTAIR表达增加和miR-17-5p表达减少,且HOTAIR靶向调控miR-17-5p.<br>　　三、NaAsO2处理的T细胞培养上清液对HSCs激活的影响<br>　　结果发现,LX-2细胞暴露在NaAsO2处理的Jurkat细胞培养上清液后,细胞内α-SMA和COL1A2蛋白水平升高呈剂量依赖性,细胞形态由梭形转变为不规则、多触须状,α-SMA表达增多,收缩胶原凝胶的能力增强.说明NaAsO2处理的T细胞培养上清液促进HSCs活化至促纤维化状态.<br>　　四、HOTAIR和miR-17-5p在NaAsO2所致Th17细胞分化及其培养上清液对肝星状细胞激活中的作用<br>　　结果发现,低表达HOTAIR或上调miR-17-p处理可以阻滞NaAsO2引起的Jurkat细胞中Th17细胞比例的增多、RORγt和IL-17A蛋白水平的升高和培养上清液中IL-17分泌的增多.此外,NaAsO2处理的Jurkat细胞培养上清液所致LX-2细胞的激活被Jurkat细胞中HOTAIR的下调或miR-17-5p的过表达抑制,表现为LX-2细胞中α-SMA和COL1A2蛋白水平降低,细胞触须数量和长度减少,α-SMA免疫信号降低,收缩胶原凝胶的能力下降.说明HOTAIR和miR-17-5p参与调节砷诱导的Th17细胞分化及其培养上清液对HSCs的激活.<br>　　五、HOTAIR调控miR-17-5p在NaAsO2所致Th17细胞分化及其培养上清液对肝星状细胞激活中的作用<br>　　结果发现,下调HOTAIR水平可以阻滞NaAsO2引起的Jurkat细胞内miR-17-5p水平的降低;阻滞NaAsO2引起的Jurkat细胞中Th17细胞比例的增多、RORγt和IL-17A蛋白水平及培养上清液IL-17水平的增加;而联合低表达miR-17-5p处理则可拮抗此效应,但是这种共同抑制引起的培养上清液中IL-17的升高不具有统计学意义.此外,低表达Jurkat细胞中HOTAIR处理可以阻滞NaAsO2处理的Jurkat细胞培养上清液所致LX-2细胞α-SMA和COL1A2蛋白水平的升高,阻滞NaAsO2处理的Jurkat细胞培养上清液所致LX-2细胞触须的延伸、α-SMA荧光强度的增加和收缩胶原凝胶能力的增强,而联合低表达miR-17-5p则可拮抗以上阻滞效应.说明HOTAIR通过miR-17-5p参与调节NaAsO2诱导的Th17细胞分化及其培养上清液对HSCs的激活.<br>　　六、沉默肝脏HOTAIR对慢性暴露NaAsO2所致小鼠肝损伤、纤维化、CD4+T细胞浸润和Th17细胞分化的影响<br>　　结果发现,沉默小鼠肝脏HOTAIR可减轻慢性暴露NaAsO2所致肝组织结构紊乱和肝细胞变性,阻滞肝组织胶原蛋白沉积;阻滞NaAsO2所致α-SMA和COL1A2免疫信号的增强和α-SMA、COL1A2蛋白水平的升高.进一步研究发现,与对照组相比,AAV-shHOTAIR处理使NaAsO2处理的小鼠肝组织中HOTAIR水平降低,miR-17-5p水平升高,抑制NaAsO2诱导的炎细胞浸润和CD4、RORγt、IL-17A表达的增多;阻滞NaAsO2所致RORγt和IL-17A蛋白水平的升高和血清中IL-17的分泌.说明沉默肝脏HOTAIR可减轻NaAsO2所致小鼠HSCs激活、ECM沉积和纤维化,其可能与HOTAIR参与调节的Th17细胞分化有关.<br>　　结论<br>　　慢性暴露NaAsO2引起T细胞内HOTAIR水平升高,HOTAIR竞争性地结合miR-17-5p使其表达水平降低,从而促进RORγt介导的Th17细胞分化,进而释放IL-17激活HSCs,导致肝纤维化.表明HOTAIR通过靶向miR-17-5p调节Th17细胞分化在砷所致肝纤维化进展中发挥重要作用.<br>　　综上所述,本研究主要发现:<br>　　1、Th17细胞参与慢性暴露NaAsO2所致肝纤维化.<br>　　2、HOTAIR通过miR-17-5p参与NaAsO2诱导的Th17细胞分化.<br>　　3、Th17细胞通过分泌IL-17A激活肝星状细胞.<br>　　4、沉默肝脏HOTAIR可减轻NaAsO2所致肝纤维化.