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摘要胞内分枝杆菌（Mycobacterium intracellulare，M. intracellulare）是一种生长缓慢的非结核分枝杆菌 （Nontuberculous mycobacteria，NTM），可以从土壤、水和动物排泄物中分离得到，是引起慢性肺部疾病的主要病因。炎症小体是一种多蛋白复合物，当机体受到危险信号刺激后，招募凋亡相关斑点样蛋白（ ASC ） ，聚集半胱氨酸蛋白酶-1 （caspase-1），进而诱导炎症小体组装。活化的 caspase-1 激活白介素-1β（IL-1β）和白介素-18（IL-18），并且能够切割消皮素D（GSDMD），切割后形成的 GSDMD-NT 能够在细胞膜上形成孔洞，使细胞溶胀破裂，发生细胞焦亡。但是，M. intracellulare 感染与炎症小体及细胞焦亡之间的关联尚不明确。本文主要对 M. intracellulare 感染小鼠巨噬细胞 J774A.1 诱导 IL-1β和 IL-18 的释放、炎症小体的激活及细胞焦亡的机制进行研究。<br>　　首先我们对 M. intracellulare 感染 J774A.1 细胞诱导 IL-1β和 IL-18 的分泌进行研究。以M. intracellulare 感染 J774A.1 细胞后，使用 ELISA 试剂盒检测感染 0.5h、1h、1.5h、2h、2.5h、3h、4h、6h 时 IL-1β和 IL-18 的分泌情况。结果发现，M. intracellulare 感染J774A.1 细胞后 IL-1β和 IL-18 分泌显著增多，且感染 2h 时分泌量达到峰值，因此后续试验感染时间均定为 2 h 。然后我们通过 qPCR 和 Western blot 检测 IL-1β和 IL-18 的表达情况。结果发现， M. intracellulare 能够诱导 IL-1β和 IL-18 显著表达。接下来我们用 qPCR 和 Western blot 检测 caspase-1 的活化情况。结果发现， M. intracellulare 能够诱导 J774A.1 细胞激活 caspase-1。为探究 IL-1β和 IL-18 的分泌是否受到 caspase-1 和K+外流的影响，我们使用浓度为 0.1μM、1μM 、10μM 的 caspase-1 抑制剂 Ac-yVAD-CHO 和 K+通道抑制剂 Glibenclamide 处理 J774A.1 细胞，通过 ELISA 检测 IL-1β和 IL-18 分泌量的变化情况。结果发现，IL-1β和 IL-18 的分泌量随抑制剂浓度的增加而下降。由此说明， M. intracellulare 感染 J774A.1 细胞诱导 IL-1β和 IL-18 的分泌受到 caspase-1 的活化及 K+外流的调控。<br>　　其次为了研究 M. intracellulare 感染 J774A.1 细胞与 NLRP3 和 AIM2 炎症小体之间的关联。我们首先用 siRNA 技术对 J774A.1 细胞进行转染，以沉默 NLRP3 和 AIM2 基因的表达，然后用 M. intracellulare 感染处理后的 J774A.1 细胞，使用 ELISA 检测 IL-1β和 IL-18 分泌量的变化情况。结果发现，在敲低 NLRP3 和 AIM2 基因功能后，IL-1β和 IL-18 的分泌量明显减少，这表明 NLRP3 和 AIM2 介导了M. intracellulare 感染 J774A.1 细胞诱导 IL-1β和 IL-18 的分泌。下一步，使用 qPCR 和 Western blot 技术检测 NLRP3 、 AIM2 、ASC 和 caspase-1 的表达情况。结果发现，M. intracellulare 诱导 J774A.1 细胞NLRP3 、 AIM2 、ASC 和 caspase-1显著表达，说明 M. intracellulare 感染 J774A.1 细胞诱导了 NLRP3 和 AIM2 炎症小体的组装。接着，我们用抑制剂 Ac-yVAD-CHO 和 Glibenclamide 处理细胞，应用 Western blot 技术研究 caspase-1 的活化和 K+外流对于 NLRP3 和 AIM2 炎症小体组装的影响。结果发现，当抑制 caspase-1 的活化和 K+外流后，M. intracellulare 感染 J774A.1 细胞诱导 NLRP3 和 AIM2 炎症小体的组装同样受到抑制。说明 M. intracellulare 诱导 J774A.1 细胞 NLRP3 和 AIM2 炎症小体的组装受 caspase-1 的活化和 K+外流的调控。<br>　　最后我们研究了 M. intracellulare 感染 J774A.1 细胞后是否诱发细胞焦亡。首先，设置正常感染组（不添加抑制剂）和抑制剂组（添加 0.1 μM、1 μM 或 10 μM 的 Ac-yVAD-CHO），然后使用乳酸脱氢酶细胞毒性检测试剂盒（LDH Cytotoxicity Assay Kit）检测各组中 LDH 的释放量，以此来判定各组细胞的细胞膜损伤情况。结果发现， M. intracellulare 感染能够引起 J774A.1 细胞细胞膜破裂，且细胞膜的损伤情况依赖于 caspase-1 的活化。接下来，我们用 qPCR 和 Western blot 技术检测 M. intracellulare 感染 J774A.1 细胞诱导 GSDMD 的切割和表达情况。结果表明，M. intracellulare 感染诱导了 J774A.1 细胞 GSDMD 的切割，产生具有成孔活性的 GSDMD-NT，表明 M. intracellulare 感染可诱导 J774A.1 细胞发生细胞焦亡。<br>　　综上所述，M. intracellulare 感染 J774A.1 细胞能够促进 IL-1β和 IL-18 的分泌、激活caspase-1 、诱导 NLRP3 、AIM2 炎症小体的组装，致使 J774A.1 细胞发生细胞焦亡。其中 IL-1β和 IL-18 的分泌及 NLRP3 和 AIM2的组装受到 caspase-1 活化和 K+外流的调控。这一发现为探索 M. intracellulare 感染机制开辟了新途径，为进一步研究其发病机制提供科学依据。