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摘要研究背景与目的：<br>　　沙门菌（Salmonella）在世界范围内引起食源性疾病的暴发。沙门菌的病原性与毒力基因有关，筛查毒力基因，比较不同来源的沙门菌菌株的基因型以及毒力基因分布，一方面可以有针对性的加强菌株溯源力度从而控制疾病进一步扩大感染，另一方面提醒有关部门潜在的疾病感染风险，从而加强食品安全风险的监测力度。通过沙门菌耐药基因检测，研究沙门菌的耐药特性，可以为沙门菌引起的食源性疾病暴发、防控及抗生素使用提供参考数据。而电化学发光（electrochemiluminescence，ECL）生物传感器为一种高效、灵敏、特异的新型电化学发光检测方法，对于沙门菌毒力基因和耐药基因快速检出以及评价食源性沙门菌污染的致病性具有重要意义。<br>　　已有研究表明，四价二氧化铈纳米材料及石墨相氮化碳能提升催化电极界面的电子迁移效率，由此增强ECL信号的强度。然而，这些材料对阴阳双极ECL信号影响的研究报道仍十分有限。论文拟在构建先进的电致发光生物传感器平台的过程中，通过调节过渡金属铈的不同价态，提升平台检测灵敏度，进而实现对痕量靶基因分析物超高灵敏度检测。研究拟集成ECL技术、纳米催化技术及滚环扩增技术的诸多优势，开发新型ECL生物传感器检测平台，评估其在实际样本检测中的应用。<br>　　材料与方法：<br>　　1. 热解法合成石墨相氮化碳（g-C3N4），分散在不同浓度梯度的N,N-二甲基甲酰胺（n,n-dimethylformamide，DMF）、四氢呋喃（tetrahydrofuran，THF）、乙腈（acetonitrile，ACN）三种有机溶剂中，研究其对过硫酸盐共反应ECL信号和荧光信号的影响；通过定量计算荧光量子产率和电致发光量子产率，探讨g-C3N4聚集诱导发光（aggregation-induced emission，AIE）性质，评价g-C3N4材料性能。<br>　　2. 研究合成聚苯胺-石墨相氮化碳-氧化铈（PANI-g-C3N4-CeⅣ）复合材料，并运用曲面响应分析方法（surface response method，RSM）定量计算g-C3N4浓度、CeO2浓度、PANI比例及搅拌时长等因素对ECL信号强度及量子产率交互影响的函数规律，优化获取最强ECL信号的PANI-g-C3N4-CeⅣ复合材料合成实验条件。以扫描电镜（scanning electron microscope，SEM）、透射电镜（transmission electron microscope，TEM）、能量色散谱（energy dispersive spectrometer，EDS）、X射线光电子能谱（ X-ray photoelectron spectroscopy ， XPS ）、紫外漫反射（ultraviolet-visible diffuse reflectance spectra，UV-Vis DRS）等表征g-C3N4纳米片调控CeO2聚集的光学性质、形态、价态、能态特点，探讨g-C3N4纳米片基底调控CeO2聚集诱导共反应增强S2O82-阴极ECL信号机理。研究结合层层自组装技术和滚环扩增技术构建沙门菌侵袭蛋白A（Invasion protein A，invA）毒力基因传感器的定量检测方法，并将目标检测方法与基因测序法对比，评估所构建传感器的检测性能。<br>　　3. 研究采用热解法制备g-C3N4-CeⅢ复合纳米材料，并通过RSM计算Ce含量、g-C3N4浓度以及合成温度等交互因素对其ECL信号强度的影响，以获得最佳ECL性能的复合纳米材料。通过SEM、TEM、EDS、XPS、UV-Vis DRS对g-C3N4掺杂CeⅢ纳米片的微观形态、能态、光学特性进行深入分析。研究基于3D打印和ITO刻蚀技术构建双极电极电化学发光检测平台，以PANI-g-C3N4-CeⅢ为固相载体，在双极电极阵列阴极界面经层层自组装联合滚环扩增构建耐药基因传感界面，引起阳极鲁米诺报告信号的浓度依赖变化，同时对沙门菌中抗氯霉素（chloramphenicol resistance，floR）、抗四环素（tetracycline resistance，tetA）、抗磺胺（sulfonamide resistance，sul）三种耐药基因定量检测。实验将ECL检测结果与基因测序及药物敏感性试验结果进行方法学对比，评估目标传感器性能。<br>　　结果：<br>　　1、AIE性质的验证实验表明，g-C3N4在DMF、THF、ACN溶液中随有机溶剂含量增高其荧光信号强度增强，荧光量子产率增加，在纯有机相中荧光强度和荧光量子产率最大；g-C3N4在DMF、THF、ACN溶液中随着有机溶剂含量降低其ECL信号增加，电致发光量子产率增加，在纯水中ECL信号强度和电致发光量子产率最大。<br>　　2、实验以g-C3N4纳米片基底调控Ce（Ⅳ）氧化物聚集固载捕获探针，捕获待测毒力基因，联合滚环扩增invA毒力基因序列后，聚集结合AuNPs标记响应探针。随待测物浓度增加，捕获AuNPs标记响应探针增加，与S2O82?阴极共反应ECL信号增强。实验结果显示，目标ECL生物传感器对invA毒力基因检测标准曲线为Y=840+2131X（R2=0.9943），线性范围为10 aM~1μM，检测限达到0.29 aM（S/N=3），加标回收率在96.7%至109.8%之间，稳定性良好（RSD＜1.50%）。实际样本检测中ECL核酸传感器的检测结果与基因测序聚类分析所得数据高度吻合。<br>　　3、实验采用ITO双极电极作为ECL传感平台，探究双极电极阴极修饰聚苯胺分散三价铈掺杂石墨相氮化碳复合纳米材料（PANI-g-C3N4-CeⅢ）对阳极鲁米诺ECL信号的影响及其发光机理，紫外漫反射表征结果表明：PANI-g-C3N4-CeⅢ比PANI-g-C3N4-CeⅣ具备更低的电子能垒，更易于促进电子传递而发生氧化还原反应生成激发态，产生更强的ECL信号。由此构建双极电极电化学发光阵列对floR、tetA、sul三种耐药基因检测的标准曲线为Y=682+6200X（R2=0.9823）、Y=794+5792X （R2=0.9742）、Y=741+6765X（R2=0.9743），线性范围为10 aM~1μM，检测限分别为0.21 aM、0.20 aM、0.11 aM（S/N=3），加标回收率在94.7%至108.3%之间，稳定性良好（RSD＜1.50%）。实验进一步与基因测序、药敏试验对floR、tetA、sul进行比较分析，基因测序结果表明floR、tetA、sul序列一致率分别为98.75%、100%、99.75%，药敏实验结果表明对氯霉素类、四环素类以及磺胺类药物均耐药，说明目标传感器检测结果与基因测序、药敏试验结果一致。<br>　　结论：<br>　　1. AIE实验的结果显示：g-C3N4有聚集诱导荧光增强性能，但并不具备聚集诱导电致发光增强性能。g-C3N4在水相基底检测中，表现出较强的ECL性能，在随后的实验设计中决定选用g-C3N4作为ECL增敏材料，构筑传感界面。<br>　　2. 基于固相固载PANI-g-C3N4-CeⅣ三元纳米复合材料共反应剂与响应探针标记AuNPs共反应促进剂的协同作用，提高S2O82?阴极ECL信号。通过滚环扩增待测基因，增加标记信号应用于细菌毒力基因检测中，与基因测序检测方法结果一致，证明该生物传感器检测方法在该领域具有较大的应用潜力。<br>　　3. 基于双极电极阴极界面固相固载PANI-g-C3N4-CeⅢ共反应剂与适配响应探针标记AuNPs共反应促进剂的联合作用，显著提升阳极鲁米诺ECL信号，构建阵列微孔对floR、tetA、sul等三种耐药基因检测，结合滚环扩增技术高效放大检测信号，在双极电极创新检测平台上，实现多目标物的一站式检测。实验进一步与基因测序和药敏试验对floR、tetA、sul进行比较分析，目标传感器与疾控实验室常用的两种手段在含量评定上表现出较高的一致性，由此验证了所提出方法在食品安全快速检测领域应用的潜力与可行性。